耳部術(shù)腔上皮缺損組織工程學(xué)修復(fù)的基礎(chǔ)研究.pdf

1、耳部病變，例如耳部腫瘤、中耳膽脂瘤、外傷、先天性畸形等手術(shù)去除病變后可遺留局部皮膚缺損，形成的顳骨裸露骨面需要修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，仍有3％-40%的患者術(shù)后上皮化進(jìn)展緩慢或上皮化不全。組織液從骨壁滲透到中耳或乳突腔可引起細(xì)菌感染和肉芽組織增生，易于形成瘢痕組織，或造成術(shù)腔狹窄。臨床上通常使用皮膚、骨膜瓣、骨粉、顳骨筋膜或者脂肪修復(fù),也有部分同種異體或異種移植物。盡管這些修復(fù)材料的應(yīng)用取得了一定的療效，但是部分再次手術(shù)病人則存在供區(qū)損傷或組織

2、數(shù)量不足的問題，目前仍未找到一種理化性質(zhì)穩(wěn)定、便于細(xì)胞定植，能支持顳骨皮膚結(jié)構(gòu)與功能恢復(fù)的上皮修復(fù)材料，以及相關(guān)的技術(shù)方法與手段。
　　本文旨在應(yīng)用組織工程原理與技術(shù)將細(xì)胞和支架材料相結(jié)合，探索通過生物制造方法，構(gòu)建組織工程化皮膚，替代和修復(fù)耳部術(shù)腔和顳骨創(chuàng)面皮膚。
　　研究目的
　?。?）建立體外分離培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）的方法，并觀察其形態(tài)及生物學(xué)

3、特性，探討其作為耳部術(shù)腔上皮組織工程種子細(xì)胞的可行性。
　?。?）構(gòu)建脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞聚合物（adipose-derived stem cell aggregates, ADSC aggregates)-細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM）復(fù)合物補(bǔ)片（ADSC aggregates-ECM)，觀察ADSCs在ECM支架上復(fù)合培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)狀況，并探討ECM作為組織工程支架材料的可行性。
　　（3）構(gòu)建

4、新西蘭兔耳廓和外耳道的皮膚缺損模型，并采用復(fù)合物補(bǔ)片和單純ECM支架兩種方式修復(fù)創(chuàng)面，比較兩種方式修復(fù)創(chuàng)面愈合情況及炎癥狀況，探討復(fù)合物補(bǔ)片促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用和機(jī)制。
　　研究方法
　　（1）優(yōu)化Zuk分離、純化和培養(yǎng)ADSCs的方法，采用誘導(dǎo)多向分化、鑒定表面分子、繪制生長(zhǎng)曲線等方法進(jìn)行干細(xì)胞生物特性驗(yàn)證。
　　（2）接種ADSCs于ECM支架上，采用掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)觀察ADSCs在ECM支架上

5、形成聚合物狀況；RT-PCR技術(shù)檢測(cè)ADSCs培養(yǎng)時(shí)自分泌活性因子情況。
　?。?）采用手術(shù)剪除和打孔的方法建立新西蘭兔耳廓和外耳道全層皮膚創(chuàng)傷模型。兩種模型均隨機(jī)分為3組，分別將復(fù)合物補(bǔ)片及單純ECM支架移植入創(chuàng)面，設(shè)立空白對(duì)照組，分別于第2、4、7周在體和組織學(xué)觀察3組術(shù)區(qū)的滲液、肉芽組織增生和感染情況，并計(jì)算創(chuàng)面愈合率；于第1、2周提取創(chuàng)面新生組織的蛋白，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，對(duì)比不同移植組促組織愈合的新生因子分

6、泌情況。
　　研究結(jié)果
　?。?）ADSCs形態(tài)均一、呈纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，具有成脂、成骨分化潛能。流式檢測(cè)ADSCs高表達(dá)CD29，CD90，低表達(dá)CD14，CD45。細(xì)胞有明顯的指數(shù)生長(zhǎng)期。
　?。?）ADSCs在ECM支架表面具有較好的粘附性，重疊生長(zhǎng)，細(xì)胞間緊密連接，未出現(xiàn)大量凋亡。且ADSCs在ECM支架上分泌HGF、TGF-β、bFGF、EGF功能明顯高于無(wú)支架組（P＜0.05）。
　　（3）在外耳道創(chuàng)面

7、模型中，術(shù)后第4周，ADSC aggregates- ECM組較ECM組、對(duì)照組上皮愈合更近似周邊組織，HE染色發(fā)現(xiàn)ADSC aggregates- ECM組較其他兩組能形成正常的上皮類似結(jié)構(gòu)。
　?。?）在第1周和第2周，ADSC aggregates-ECM組和ECM組缺損部位分泌的bFGF EGF, HGF,VEGF和TGF-β1顯著高于對(duì)照組。
　?。?）耳廓?jiǎng)?chuàng)面模型中，術(shù)后第2周，ADSC aggregates-E

8、CM組創(chuàng)面愈合率明顯高于ECM組和對(duì)照組。組織學(xué)HE染色發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組較另外兩組創(chuàng)面浸潤(rùn)大量炎性細(xì)胞。第4周，三組創(chuàng)面皮膚均愈合，炎性細(xì)胞減少。第7周，三組創(chuàng)面瘢痕逐漸減退。ADSC aggregates-ECM組和ECM組瘢痕厚度均低于對(duì)照組（p＜0.05)。
　　研究結(jié)論
　　（1）體外培養(yǎng)的兔ADSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性，可作為耳部術(shù)腔上皮組織工程種子細(xì)胞。
　?。?）ECM支架為細(xì)胞的生長(zhǎng)、爬行提供了良好的微環(huán)