我國部分昆蟲螺原體的基本特性及其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析.pdf

1、在我國有關(guān)螺原體（spiroplasma）的研究很少，研究力量十分薄弱，所以應(yīng)調(diào)查我國昆蟲螺原體的存在情況，收集昆蟲螺原體資源，將有助于充分認(rèn)識(shí)和利用這類重要的微生物資源。本研究于2007-2008年，在南京地區(qū)采集200多種昆蟲，采用螺原體常規(guī)分離、培養(yǎng)方法，分別在雙翅目、鱗翅目、膜翅目昆蟲中分離到6株螺原體XW0801、MW0801、MF0801、BE0801、YY0801和MF0802。之后應(yīng)用暗視野顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察螺原

2、體形態(tài)，并對(duì)分離菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、基本生物學(xué)、分子生物學(xué)特性及血清學(xué)的研究。此外，還研究了蜜蜂螺原體菌株MF0801和MF0802對(duì)意大利蜜蜂（Apis mellifera）的致病性以及對(duì)一些中草藥的敏感性。
　　 通過對(duì)分離菌株的宿主進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，6株螺原體分離宿主分別為雙翅目的黑翅蕈蚊（Bradysia tritici）、舞虻（Empididae）科昆蟲、黃道蚜蠅（Phytomiazonata）；鱗翅目的白帶斑蛾（Chalco

3、sia remota）；膜翅目的意大利蜜蜂（A.mellifera）和中華蜜蜂（Apis cerana）。對(duì)分離菌株進(jìn)行基本生物學(xué)特性研究結(jié)果表明：分離菌株在R2液體培養(yǎng)基中都生長良好，都能通過孔徑為0.22μm、0.45μm的微孔濾膜；透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)分離菌株在對(duì)數(shù)生長期都可呈典型的螺旋狀；在固體培養(yǎng)基上都呈圓形或顆粒狀菌落，有些可見衛(wèi)星菌落，菌落直徑在30-180μm之間變化；都能利用葡萄糖、D-果糖作為碳源；代謝精氨酸的能力

4、稍有差異；都不能利用尿素，在含氨芐青霉素鈉（2000 U/mL）的R2液體培養(yǎng)基中都生長良好；在最適生長溫度下，所有菌株的生長曲線都與蜜蜂螺原體（Spiroplasma mellferum）相似；在血清學(xué)生長抑制試驗(yàn)中所有菌株都與S.melliferum有較為明顯的交叉反應(yīng)，只有菌株BE0801與S.melliferum的抑菌距離較小。
　　 采用Chelex-100法提取螺原體DNA，然后對(duì)其16S rDNA、ITS、rpoB

5、基因序列進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)螺原體屬內(nèi)所有已經(jīng)建立的種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，6株螺原體分離菌株都與S.melliferum聚為一枝。在用RAPD對(duì)實(shí)驗(yàn)室的13株昆蟲及植物花螺原體進(jìn)行遺傳多樣性分析時(shí)，當(dāng)相似性系數(shù)為0.4時(shí)，13個(gè)螺原體菌株分為4個(gè)分枝：A分枝主要包括蜜蜂螺原體菌株S.melliferum、MF0801、M10、MF0802；油菜花螺原體CR-1、CNR-1和杜鵑花螺原體CNA-1；B分枝包括屬于鱗翅目的白帶斑蛾螺原體B

6、E0801和屬于雙翅目的分離自舞虻、黑翅蕈蚊、黃道蚜蠅的螺原體WM0801、XW0801、YY0801；C分枝僅包括一株分離自紅花酢漿草的螺原體菌株CRW-1；D分枝也只包括一株油菜花螺原體CNR-2。
　　 通過飼喂新鮮菌液的方法對(duì)蜜蜂螺原體進(jìn)行致病性研究，發(fā)現(xiàn)感染菌株MF0801的意大利蜜蜂（Apis mellifera）在第3、4d出現(xiàn)類似“爬蜂病”癥狀，第15d時(shí)A.mellifera校正死亡率達(dá)到41％。而感染菌株MF

7、0802的A.mellifera校正死亡率僅為11％，在飼喂過程中也沒有發(fā)現(xiàn)典型的“爬蜂病”癥狀。表明分離自A.mellifera的菌株MF0801具有較強(qiáng)的致病性，而菌株MF0802對(duì)則相對(duì)致病能力較弱。利用水蒸餾法提取中草藥野菊花（Chrysanthemum indicum）、公丁香（Eugenia caryophyllata）、魚腥草（Houttuyniacordata）、生姜（Zingiber officinale）的揮發(fā)油，制

8、備其飽和水溶液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種中藥的揮發(fā)油均對(duì)蜜蜂螺原體有抑制作用，但抑菌能力魚腥草最大，姜、公丁香和野菊花依次遞減。且對(duì)照菌株S.melliferum和意大利蜜蜂螺原體MF0801對(duì)4種中藥揮發(fā)油飽和水溶液耐受能力較中華蜜蜂螺原體MF0802強(qiáng)。
　　 本研究通過對(duì)6株昆蟲螺原體進(jìn)行形態(tài)學(xué)、基本生物學(xué)、分子生物學(xué)特性、血清學(xué)及致病性方面的研究。初步推斷分離自蜜蜂的螺原體MF0801和MF0802屬于S.mellife