盤基網(wǎng)柄菌發(fā)育期間蛞蝓體的形態(tài)學以及類免疫細胞的研究.pdf

1、盤基網(wǎng)柄菌(Dictyostelium discoideum)隸屬原生動物,是一類社會阿米巴蟲,當生長條件良好時,細胞會以二分裂方式來繁殖后代;當生存環(huán)境惡劣時,進行多細胞發(fā)育,整個發(fā)育過程約需24 h,大致分4個階段:細胞聚集(aggregation)階段、細胞丘(mound)階段、蛞蝓體(slug)階段和子實體(fruiting body)階段。蛞蝓體可細分為“突起”時期、“蛞蝓”時期和“拔頂”時期。蛞蝓體階段的細胞分為前柄細胞和前

2、孢子細胞兩大類,前柄細胞又可分PstA細胞、PstB細胞、PstO細胞和PstAB細胞;前孢子細胞只有Psp細胞。到子實體階段前柄細胞發(fā)育成柄細胞,前孢子細胞發(fā)育成孢子細胞,一旦條件合適,孢子細胞萌發(fā)開始新生命周期,而柄細胞無論在什么條件下都不能萌發(fā),因此柄細胞是凋亡細胞。可見,盤基網(wǎng)柄菌細胞發(fā)育和高等生物發(fā)育相似,同樣存在著細胞分化和細胞凋亡現(xiàn)象。蛞蝓體時期是細胞分化和細胞開始衰退的起始階段。由于受到環(huán)境影響及其個體大小存在差異,蛞蝓

3、體的個體發(fā)育的并不是完全同步的,但整個蛞蝓體階段只有兩個小時,故以往都把蛞蝓體看成一個時期,蛞蝓體具體的形態(tài)發(fā)育過程卻未見報道。由于各類細胞運動速度不同,蛞蝓體形態(tài)發(fā)生了巨大的變化。本工作用吖啶橙(Acridine orange,AO)和Hoechst33342(HO)兩種活體熒光染料,在盤基網(wǎng)柄菌細胞發(fā)育活體狀念下,通過熒光顯微鏡觀察盤基網(wǎng)柄菌細胞的分化情況,以期了解盤基網(wǎng)柄菌細胞發(fā)育,特別是蛞蝓體發(fā)育的具體過程及發(fā)育過程中出現(xiàn)的細胞

4、分化及凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):占整個蛞蝓體近4/5細胞的細胞核在整個發(fā)育過程中始終都染成藍色,細胞未見衰退跡象,因此最終發(fā)育成孢子細胞。這與孢子細胞能夠萌發(fā),形成新的生命體是相符合的。而位于蛞蝓體前部,占整個蛞蝓體1/5細胞的細胞核隨著發(fā)育進程,細胞核先被染成藍綠色,然后被染成綠色,再成橙色,直到最后顯不出顏色。發(fā)育至蛞蝓體后期時,在蛞蝓體內(nèi)部可看到一“通道”,“通道”內(nèi)部被染成綠色,在發(fā)育成子實體時候,在“通道”內(nèi)部可見淺藍綠色的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

5、,并且蛞蝓體時期的“通道”位置與子實體時期的柄的位置一致,由此推測,子實體的柄極有可能是“通道”發(fā)育而來的。這些數(shù)據(jù)提示從蛞蝓體前期開始,前柄細胞就已經(jīng)開始凋亡,但細胞并不是馬上死亡,而是一個漸進的凋亡過程,細胞核的功能一開始并不是完全消失,而是隨著細胞凋亡進程,逐漸喪失其功能,前柄細胞徹底凋亡后其細胞核才徹底喪失。因此按照染色的結(jié)果來看,蛞蝓體前柄細胞發(fā)育至少可分成4個時期,藍綠色期、綠色期、橙色期和無色期。因此可以通過細胞核著色不同

6、,來了解具體形態(tài)發(fā)育過程及其細胞的衰退程度,這為以后研究盤基網(wǎng)柄菌的發(fā)育提供依據(jù)。在實驗過程中,筆者發(fā)現(xiàn)當Hoechst33342的濃度高于10μg/mL時,不再僅僅染活細胞的細胞核,會引起細胞死亡或引起細胞發(fā)生某些應(yīng)急反應(yīng),即對盤基網(wǎng)柄菌產(chǎn)生毒性效應(yīng)。在蛞蝓體階段會出現(xiàn)一類吞噬Hoechst33342有毒物質(zhì)的細胞。這類有特殊的功能細胞與高等生物的的免疫細胞功能相似,也有解毒和免疫樣活性,筆者稱之為類免疫細胞。為了進一步驗證類免疫細胞

7、的存在,實驗中用熒光染料EB作為盤基網(wǎng)柄菌生長環(huán)境中所遇毒物的替代品,通過熒光顯微鏡觀察,激光共聚焦顯微鏡觀察定位以及流式細胞儀來確定類免疫細胞的所處細胞群及其所占細胞比例。已知EB除了有毒外還可以穿過受損細胞膜對細胞核著色,我們先通過熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察定位實驗后發(fā)現(xiàn),EB并不是定位在細胞核中,因而說明其不是與DNA結(jié)合而顯色的,而是被包裹在細胞內(nèi)。通過熒光顯微鏡觀察研究發(fā)現(xiàn)類免疫細胞不但能吞噬EB,把EB包裹在類免疫細胞

8、中,防止對蛞蝓體的毒害,而且發(fā)現(xiàn)隨著蛞蝓體移動,含EB的細胞團留在遺棄的粘液鞘中,最終將毒物脫出體外。表明在動物進化到多細胞之前,有覓食功能的單細胞低等真核生物已經(jīng)具備有防御能力。通過流式細胞儀的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),這些類免疫細胞主要來自于前柄細胞,猜想是前柄細胞中的一類特殊細胞。目前我們只是在形態(tài)上和來源上對這些細胞進行了研究,但對這類類免疫細胞的免疫相關(guān)蛋白,類免疫細胞是在毒物誘導(dǎo)后產(chǎn)生還是毒物誘導(dǎo)前就已經(jīng)存在的,在毒物被排除后,類免疫細