人類基因組復(fù)雜序列區(qū)域的擴(kuò)增與測(cè)序策略研究.pdf

1、雖然人類基因組計(jì)劃已經(jīng)于2004年宣布完成,但是已完成的人類基因組并不完美,這其中仍然存在著數(shù)百個(gè)大大小小的測(cè)序缺口,并且五年時(shí)間已經(jīng)過去,這些問題依然還未解決。目前人們對(duì)這些測(cè)序缺口的特征認(rèn)識(shí)還很有限,一般認(rèn)為,它們通常都具有復(fù)雜的序列結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致對(duì)這些區(qū)域所進(jìn)行的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)存在擴(kuò)增效率低、擴(kuò)增特異性差以及擴(kuò)增產(chǎn)物難克隆等多重困難?，F(xiàn)有的技術(shù)還無法解決這些問題,需要依賴于

2、新的研究成果和技術(shù)突破。納米粒子PCR作為一項(xiàng)新興的納米生物技術(shù),具有傳統(tǒng)的PCR優(yōu)化方法所不具有的多重優(yōu)化作用,對(duì)解決這類問題具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　 本文以人類基因組5號(hào)染色體上的一個(gè)測(cè)序缺口作為研究體系,通過結(jié)合納米粒子PCR技術(shù)、DNA分子的原子力顯微成像技術(shù)和巢式PCR、分子克隆等分子生物學(xué)方法,對(duì)該測(cè)序缺口進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序及序列分析,并最終獲得了完整的序列。
　　 研究結(jié)果表明:
　　 1.由于擴(kuò)增體

3、系過于復(fù)雜的原因,單獨(dú)地采用納米粒子PCR并不能起到有效的優(yōu)化作用。但是將納米粒子PCR同巢式PCR相結(jié)合,可以改善巢式PCR在擴(kuò)增復(fù)雜序列區(qū)域時(shí)仍然存在的擴(kuò)增效率和擴(kuò)增特異性的不足。其中擴(kuò)增特異性的提高還體現(xiàn)在擴(kuò)增產(chǎn)物用于測(cè)序具有更高的測(cè)序質(zhì)量。該特性對(duì)于我們獲得該測(cè)序缺口的部分序列并作為進(jìn)行下一步研究的基礎(chǔ)起到了關(guān)鍵的作用。
　　 2.該測(cè)序缺口中包含了一段特別復(fù)雜的區(qū)域,并導(dǎo)致:a.多對(duì)引物用于擴(kuò)增這一區(qū)域都出現(xiàn)了擴(kuò)增產(chǎn)物

4、長(zhǎng)度多態(tài)性;b.擴(kuò)增產(chǎn)物中的一些片段克隆后的測(cè)序結(jié)果與克隆前不一致,測(cè)序結(jié)果長(zhǎng)度要明顯短于用于克隆的樣品;c.完整地包含了這一區(qū)域的片段用于克隆效率很低;d.部分?jǐn)U增產(chǎn)物還易形成十字型二級(jí)結(jié)構(gòu)。對(duì)最終測(cè)序結(jié)果的序列分析也證實(shí),該區(qū)域?yàn)橐欢瓮瑫r(shí)富含正向重復(fù)和反向重復(fù)的序列,并且是這兩類重復(fù)序列的共同作用導(dǎo)致了擴(kuò)增易發(fā)生片段丟失和擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度多態(tài)性。這些發(fā)現(xiàn)解釋了該測(cè)序缺口存在并難以解決的原因,對(duì)于我們進(jìn)一步了解測(cè)序缺口的結(jié)構(gòu)特征并發(fā)展更完