葉酸及其部分代謝因素對人類基因組穩(wěn)定性的作用機制研究.pdf

1、葉酸(folate,FL)是DNA代謝活動所必需的一種微量營養(yǎng)素(micmnutrient)，人體不能合成，需從食物中獲取。FL包括眾多衍生物，藥物和強化食品中所添加的葉酸為FL的合成形式——folicacid(FA)。葉酸代謝涉及DNA合成和DNA甲基化二個重要生化過程，因此與DNA復制、損傷修復、基因表達和細胞增殖等過程緊密相關(guān)；葉酸代謝需要多種酶和輔助因子參與，其中亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)的催化作用對DNA甲基化過程或D

2、NA合成之間的分支走向發(fā)揮著關(guān)鍵作用，核黃素(riboflavin，RF)作為MTHFR的重要輔助成分，亦存在影響葉酸代謝的可能性。 本論文旨在探討葉酸、核黃素、MTHFR基因型多態(tài)性等葉酸代謝因素對人類基因組穩(wěn)定性的作用及其機制，初步界定以維護基因組穩(wěn)定性為目標的葉酸、核黃素推薦日攝取量(RecommendedDietaryAllowances，RDA)。研究采用放射免疫法、胞質(zhì)分裂阻斷微核分析(CBMN)、熒光原位雜交(FI

3、SH)、多重PCR-RFLP(MultiplexPCR-RFLP)等技術(shù)，比較分析了正常女性與乳腺癌患者血漿／紅細胞葉酸濃度、正常女性和乳腺癌患者淋巴細胞基因組對葉酸缺乏的敏感性差異，解析了差異形成的可能機制；研究了不同氧化形式葉酸FA和5一亞甲基四氫葉酸(MeTHF)對人類基因組穩(wěn)定性與17、21號染色體分離的作用差異；探討了非癌正常對照與乳腺癌患者MTHFRC677T、A1298C多態(tài)性分布、FA--RF不同濃度組合對各種MTHFR

4、基因型個體基因組穩(wěn)定性的作用與機制。 研究發(fā)現(xiàn)：(1)乳腺癌患者血漿和紅細胞總?cè)~酸濃度均顯著低于對照(P<0．001)，提示人體葉酸狀況與乳腺癌危險度有一定關(guān)聯(lián)；(2)離體條件下，F(xiàn)A為30nM時，病例及對照淋巴細胞主要遺傳損傷標志(微核化雙核細胞，MNedBNC；核質(zhì)橋，NPB；核芽，BUD)均顯著高于120nM和240nMFA組(P<0．001)，但120nM和240nMFA組間無顯著差異，因此，120nMFA在本試驗系統(tǒng)下

5、是維護基因組穩(wěn)定性的最適濃度；(3)乳腺癌患者的遺傳損傷程度和細胞毒性水平均高于對照((P≤O．005)，但以DifferenceofDifferenceAnalysis(DDA)排除二組樣本之間的遺傳損傷基線(baseline)差異后，發(fā)現(xiàn)他們對FA缺乏的遺傳損傷和細胞死亡敏感性無顯著差異，提示高遺傳損傷基線和葉酸缺乏引起的遺傳不穩(wěn)定均構(gòu)成乳腺癌的危險因素；FA對MNedBNC、NPB、BUD、APO(細胞凋亡)及NEC(細胞壞死)的

6、變異貢獻分別為60％、39％、39％、52％和71％，而樣本(腫瘤狀態(tài))狀況對MNedBNC和NEC變異貢獻僅6％和7％，提示葉酸對基因組穩(wěn)定性和細胞死亡的作用顯著高于腫瘤狀況：(4)FA和MeTHF這二種形式的葉酸在120nM時均顯著降低其相同形式的12nM組MNedBNC頻率(P<0．05)，二種形式葉酸缺乏誘發(fā)非整倍體也表現(xiàn)同樣的趨勢，高濃度葉酸組17和21號染色體非整倍體頻率分別比低濃度降低26％和35％，但MeTHF消弱遺傳損

7、傷的能力顯著低于FA。結(jié)果證實了葉酸維護基因組穩(wěn)定性的重要作用，但不支持MeTHF防范遺傳損傷能力更強的假設(shè)；(5)MTHFRC677T和A1298C多態(tài)基因型分布在對照與乳腺癌患者間未出現(xiàn)顯著性差異；(6)低FA-低RF培養(yǎng)基組合使對照與病例的遺傳損傷率均達最高水平，而高FA-低RF組合使遺傳損傷水平降至最低；在C677T多態(tài)性個體中，高FA條件使對照MNedBNC、BUD、NPB頻率分別降低43％、48％、44％，病例組降低35％、

8、45％和34％；而高RF條件下相應(yīng)遺傳損傷僅降低3—10％。在A1298C多態(tài)性個體中，高FA使對照MNedBNC、BUD、NPB頻率分別降低42％、55％和36％，病例組降低37％、45％和36％；高RF使對照BUD和NPB水平降低11％和18％，病例組中NPB降低11％。結(jié)果有力地證明了FA維護基因組穩(wěn)定性的效率顯著高于RF；(7)MTHFR野生型純合子677CC、1298AA基因組穩(wěn)定性高于突變純合子677TT和1298CC~(8

9、)677CC、1298AA乳腺癌個體基因組穩(wěn)定性顯著低于相同基因型的對照，但DDA分析卻揭示他們對FA、RF缺乏的遺傳損傷敏感性無顯著差異，因此，乳腺癌患者基因組穩(wěn)定性除受FA、RF和MTHFR多態(tài)性的影響外，還受到其他內(nèi)源因素的作用。 本研究從營養(yǎng)基因組學的角度探討FA、RF和MTHFR多態(tài)性對正常人／乳腺癌患者基因組穩(wěn)定性的作用與機制，證實了120nMFA為離體條件下維護淋巴細胞基因組穩(wěn)定性的最適濃度，盡管其未精確反映活體對