2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、目的1、利用抗葉酸代謝藥MTX 建立神經(jīng)管畸形小鼠模型。2、研究MTX 誘導(dǎo)神經(jīng)管畸形小鼠胚胎神經(jīng)組織基因組拷貝數(shù)變異以及甲基化的改變。3、觀察MTX 抑制葉酸代謝對(duì)神經(jīng)管畸形小鼠胚胎神經(jīng)上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
   方法1、甲氨蝶呤誘導(dǎo)神經(jīng)管畸形小鼠模型的建立C57BL/6 孕鼠在懷孕第7.5天腹腔注射不同劑量的MTX,懷孕第11.5天處死孕鼠,體視顯微鏡下取出胚胎,觀察其發(fā)育情況,記錄活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎數(shù)、畸形胎數(shù),

2、計(jì)算畸形率,逐一測(cè)量胚胎的體長(zhǎng)和體重。將部分正常胚胎和神經(jīng)管畸形胚胎固定于10%中性福爾馬林中。取出固定的全胚胎組織,進(jìn)行石蠟包埋,連續(xù)切片,HE 染色,光學(xué)顯微鏡下觀察。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選最佳造模劑量。2、微陣列比較基因組雜交技術(shù)檢測(cè)MTX 誘導(dǎo)神經(jīng)管畸形胚胎神經(jīng)組織基因組拷貝數(shù)變異(CNV)應(yīng)用高分辨微陣列比較基因組雜交技術(shù)(aCGH)檢測(cè)正常和神經(jīng)管畸形胚胎基因組CNV,設(shè)定log2 ratio means?0.45;CNvs探針密

3、度?5;長(zhǎng)度?10Kb為高可信度CNV 標(biāo)準(zhǔn)篩選CNV。并聯(lián)合RT-PCR和MassARRAY平臺(tái)對(duì)高可信度CNV 進(jìn)行驗(yàn)證,用GO對(duì)位于高可信度CNV上的基因進(jìn)行注釋,篩選候選基因。3、全基因組甲基化芯片檢測(cè)MTX 誘導(dǎo)神經(jīng)管畸形胚胎神經(jīng)組織基因組甲基化的改變應(yīng)用全基因組甲基化芯片檢測(cè)正常和神經(jīng)管畸形胚胎基因組甲基化的改變。設(shè)定peak同時(shí)在3個(gè)神經(jīng)管畸形樣品都發(fā)生改變,且peak的log2 ratio means?0.5為標(biāo)準(zhǔn)篩選高

4、可信度peak,即發(fā)生甲基化改變的區(qū)域,并對(duì)發(fā)生甲基化改變的基因進(jìn)行GO分析,同時(shí)用RT-PCR(reverse transcription PCR)方法觀察候選基因的表達(dá)情況。4、MTX 抑制葉酸代謝對(duì)神經(jīng)管畸形小鼠胚胎神經(jīng)上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響應(yīng)用TUNEL 方法觀察神經(jīng)管畸形小鼠胚胎神經(jīng)管上皮細(xì)胞的凋亡情況。應(yīng)用免疫組化的方法觀察pH3蛋白在神經(jīng)管上皮細(xì)胞的表達(dá),從而反映細(xì)胞的增殖情況。應(yīng)用免疫組化和western-blotti

5、ng的方法檢測(cè)小鼠胚胎腦caspase3的表達(dá)情況。
   結(jié)果1、成功建立了葉酸代謝障礙的神經(jīng)管畸形動(dòng)物模型,C57BL/6 孕鼠在懷孕第7.5天腹腔注射4.5mg/kg 體重MTX為最佳造模方案,神經(jīng)管畸形的發(fā)生率為31.4%。小鼠胚胎組織的DHFR 活性在注射MTX4.5mg/kg 體重4~8小時(shí)后降到最低,12小時(shí)以后開(kāi)始恢復(fù),但是仍然低于注射前。小鼠全胚胎連續(xù)切片HE 染色結(jié)果顯示,神經(jīng)管畸形多數(shù)表現(xiàn)為神經(jīng)管后腦未閉合

6、畸形,少數(shù)表現(xiàn)為神經(jīng)管全腦未閉合畸形,顱脊柱裂等。2、與正常胚胎相比,NTDs小鼠胚胎gDNA 缺失的片段共12個(gè)。主要在7 號(hào)、9 號(hào)、11號(hào)以及X 染色體。缺失長(zhǎng)度從5Kb-18Mb不等;擴(kuò)增的片段共9個(gè),均位于6 號(hào)染色體,長(zhǎng)度在3Kb-5Kb不等。進(jìn)行高可信度標(biāo)準(zhǔn)篩選后,3個(gè)CNV 被認(rèn)為是高可信度CNV,且這3個(gè)CNV 均位于X 染色體,對(duì)這3個(gè)CNV 進(jìn)行驗(yàn)證以后證實(shí)這3個(gè)片段拷貝數(shù)缺失。GO 結(jié)果顯示位于這3個(gè)CNVs上所

7、有的103個(gè)基因中,參與細(xì)胞代謝過(guò)程的基因數(shù)量最多,有25個(gè)。參與其他生物學(xué)過(guò)程還包括:物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等等。3、與正常胚胎相比,3個(gè)NTDs小鼠胚胎共同發(fā)生低甲基化的區(qū)域有35個(gè),3個(gè)NTDs小鼠胚胎共同發(fā)生高甲基化的區(qū)域有97個(gè),進(jìn)行高可信度篩選以后,26個(gè)區(qū)域被認(rèn)為具有高可信度,驚奇地是,這26個(gè)區(qū)域均位于X 染色體,并且在NTDs小鼠胚胎都為低甲基化。這些區(qū)域大多數(shù)位于基因的啟動(dòng)子區(qū)(promoter),少

8、數(shù)位于基因內(nèi)(within),或者基因的上下游(left、right),基因注釋后結(jié)果顯示,這些區(qū)域影響到的基因共30個(gè),其中3個(gè)基因是同時(shí)發(fā)生了CNV 缺失和低甲基化,這3個(gè)基因分別為Ebp、Otud5、Maoa。4、TUNEL和pH3免疫組化結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比,NTD小鼠胚胎神經(jīng)上皮細(xì)胞增殖減少(P<0.05),凋亡增加(P<0.05);與正常組相比,caspase 3在腦的表達(dá)增加(P<0.05)。
   結(jié)論1、

9、本研究應(yīng)用抗葉酸代謝藥MTX 抑制了小鼠胚胎葉酸代謝通路,成功建立了神經(jīng)管畸形的小鼠模型,進(jìn)一步證實(shí)了葉酸缺乏及其相關(guān)代謝障礙與神經(jīng)管畸形的密切關(guān)系。2、MTX通過(guò)抑制小鼠胚胎的葉酸代謝通路,引起小鼠胚胎基因組發(fā)生拷貝數(shù)變異以及甲基化的改變,導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定性,其中對(duì)X 染色體的影響最大。葉酸代謝障礙所導(dǎo)致的基因組的不穩(wěn)定性可能是神經(jīng)管畸形發(fā)生的分子機(jī)制。3、神經(jīng)管畸形小鼠神經(jīng)上皮細(xì)胞增殖減少、凋亡增加。增殖減少可能是由于DNA/RN

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