培美曲塞誘導神經管畸形動物模型及其機制的研究.pdf

1、研究目的：本研究利用抗葉酸代謝藥培美曲塞（PMX）對C57BL/6J孕鼠進行藥物干預，通過對孕鼠胚胎形態(tài)學觀察及其他指標的檢測，篩選出最佳的給藥劑量和時間，建立葉酸代謝障礙的C57BL/6J小鼠胚胎神經管畸形(neuraltubedefects，NTDs)動物模型；采用微陣列比較基因組雜交技術(aCGH)檢測PMX誘導NTDs模型基因組拷貝數變異；應用全基因組表達譜芯片技術檢測PMX誘導NTDs模型的基因表達譜,篩選可能的PMX引起NT

2、Ds的致病基因；初步探討PMX對NTDs發(fā)生發(fā)展的影響及相關發(fā)病機制的研究。
　　研究方法：本研究中將7～8周健康雌性C57BL/6J小鼠隨機分兩組受孕，給藥實驗組于孕7.5（E7.5）天腹腔注射PMX，摸索適當的給藥劑量并建立神經管畸形動物模型，正常對照組按體重注射同等劑量的生理鹽水。在孕11.5（E11.5）天，頸椎離斷處死實驗組和正常對照組孕鼠，取胚胎于在解剖顯微鏡下觀察胚胎神經管畸形的外部特征；經固定、切片、染色后，光鏡下

3、觀察畸胎情況及神經管形態(tài)改變；高效液相色譜法首先測定PMX干預孕鼠的不同時間點的葉酸及代謝產物水平；ELISA方法檢測PMX誘導的E7.5天胚胎組織葉酸水平；測定胚胎組織的二氫葉酸還原酶（DHFR）活性；RT-PCR法檢測胚胎組織葉酸代謝途徑關鍵酶的基因表達水平。應用高分辨微陣列比較基因組雜交技術檢測PMX誘導小鼠NTDs模型基因組拷貝數變異，經過生物信息學UCSC比對并應用RT-PCR分析；應用全基因組表達譜芯片技術高通量篩選出在NT

4、Ds小鼠胚胎中異常表達的基因，并對這些差異表達基因進行GO分析，對所篩選出的Ptch1基因、Endog基因進行RT-PCR方法進行驗證。體外實驗檢測PMX對小鼠胚胎干細胞氧化應激損傷；應用單細胞凝膠電泳方法檢測PMX對小鼠胚胎干細胞的DNA損傷的影響。
　　研究結果：
　　1.PMX具有明顯的胚胎致畸性，可導致孕鼠子宮明顯充血、淤血，大體外觀可見吸收胎、胎鼠發(fā)育遲緩及NTDs形態(tài)表現，HE染色可見NTDs胎鼠后腦泡未閉合。<

5、br>　　2.E7.5天注射PMX后，在4、12小時孕鼠血中葉酸明顯高于正常，24、96h接近于正常水平；5-FoTHF變化不大，5-MeTHF,,SAM,SAH四個指標表現不同程度的降低，在24h開始慢慢恢復，但96h仍低于正常水平，具有統(tǒng)計學意義p＜0.05。，同時PMX明顯降低實驗組的胚胎組織葉酸水平。DHFR活性在4～8小時后降到最低，僅為正常小鼠胚胎組織的15％，隨后DHFR的活性開始恢復，但是在PMX注射24小時后，DHFR

6、活性仍然低于正常水平。實驗組小鼠胚胎組織結果顯示實驗組小鼠胚胎組織亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）和腺苷酸合酶（TS）的mRNA表達水平低于對照組小鼠胚胎組織（p<0.05）。
　　3.應用高分辨微陣列比較基因組雜交技術（Arraycomparativegenomichybridization,aCGH）對NTDs小鼠胚胎基因組拷貝數變異（Copynumbervariations,CNVs）進行檢測，結果顯示共篩選出313個拷貝

7、數變異片段，包含101個變異基因。在表達譜中篩選出的差異表達基因共165個，表達上調的基因有96個，表達下調的基因有69個。這些與正常組織表達有差異基因包括代謝相關基因；發(fā)育相關基因；信號轉導相關基因；轉錄相關基因；物質轉運相關基因；應激相關基因；離子轉運相關基因；細胞凋亡相關基因；細胞增殖相關基因；細胞分化相關基因；細胞粘附相關基因；細胞周期相關基因等。其中RT-PCR驗證結果與表達譜芯片結果一致（p<0.05）。
　　4.單細

8、胞凝膠電泳結果顯示PMX對小鼠胚胎干細胞DNA有損傷，并且有劑量依賴性。隨著PMX濃度的增加，DNA拖尾越明顯；同時造成小鼠胚胎干細胞的氧化應激損傷。
　　結論：
　　1.PMX能成功的誘導C57BL/6J小鼠胚胎NTDs，是一種接近人類的NTDs的動物模型。
　　2.抗葉酸代謝藥PMX可以抑制小鼠葉酸及其相關產物的代謝，NTDs胚胎發(fā)生基因組拷貝數變異。
　　3.Ptch1基因的上調和Endog基因表達的下調在