新型LED人工光源的眼生物安全性的實驗研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 不同相關(guān)色溫的LED白光輻射對人晶體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激及DNA損傷的實驗研究
　　目的:
　　氧化應(yīng)激造成的晶狀體上皮細(xì)胞(human lens epithelial cells，HLECs)損傷是白內(nèi)障形成的最重要因素之一。發(fā)光二極管(light-emitting diodes，LED)產(chǎn)生的復(fù)色白光中含有高比例的短波藍(lán)光成分，長期的LED白光暴露可能造成對HLECs氧化

2、損傷。本研究探討了不同相關(guān)色溫(correlated color temperature，CCT)的LED白光對體外培養(yǎng)的HLECs的細(xì)胞增殖，細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，DNA損傷，細(xì)胞周期及凋亡的影響，初步探究LED光源的眼生物安全性。
　　方法:
　　培養(yǎng)的HLECs暴露于CCT分別為2954K，5624K及7378K的LED復(fù)色白光輻射下，LED系統(tǒng)（中國鴻雁電器科技公司

3、提供）光照循環(huán)周期為16小時-開/8小時-關(guān)。在不同光照度及不同時間的光輻射暴露后，利用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖，2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(H2DCFHDA)探針法檢測胞內(nèi)ROS，堿性彗星試驗檢測DNA損傷，流式法檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡，蛋白免疫印跡及實時定量PCR(RT-qPCR)檢測PARP-1，p53及p21 mRNA及蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　與正常對照組相比，在1500lux的7378K LED白光刺激2天

4、后，細(xì)胞增殖活力的顯著降低，而2954K組及5624K組未觀察到顯著性改變。在2500lux7378KLED白光刺激3天后，HLECs的細(xì)胞活力下降68.26％;在不同光照度及輻射時間下，7378K組造成了細(xì)胞內(nèi)最為顯著的ROS增加;堿性彗星實驗顯示2954KLED白光對DNA未造成顯著的損傷，而5624K組及7378K組DNA損傷均顯著增多;5624K及7378K1500lux刺激2天后，HLECs出現(xiàn)G2/M期阻滯，而2954K組無

5、顯著改變;僅7378K組在1500及2500lux光照度下可以引起顯著的細(xì)胞凋亡增多，PARP-1，p53及p21 waf1/cip1表達(dá)均顯著上升。
　　結(jié)論:
　　與2954K及5624K LED白光相比，CCT較高的7378K LED復(fù)色白光暴露能誘導(dǎo)HLECs內(nèi)ROS的過度生成，從而抑制細(xì)胞增殖活力，造成顯著的DNA損傷，誘導(dǎo)了細(xì)胞G2/M期阻滯及凋亡。
　　第二部分 兩種不同相關(guān)色溫的LED白光輻射對人原代視

6、網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞病理性細(xì)胞因子表達(dá)影響及相關(guān)信號通路機(jī)制研究
　　目的:
　　年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是老年人失明的主要原因。最近的系統(tǒng)性回顧研究顯示，過度的日光（含藍(lán)光）暴露增加AMD的患病風(fēng)險。隨著高效的發(fā)光二極管(light-emitting diodes，LED)發(fā)光技術(shù)在我們生活環(huán)境中的廣泛使用，LED產(chǎn)生的大量藍(lán)光對眼組織的潛在氧化應(yīng)激損傷威脅

7、不容忽視。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)是眼組織病理性細(xì)胞因子的主要來源，調(diào)節(jié)外層視網(wǎng)膜局部炎癥反應(yīng)和血管生成。本研究探討了兩種不同相關(guān)色溫(correlated color temperature，CCT)的LED白光對分離的原代人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelial cells，RPECs)幾種病理性細(xì)胞因子表達(dá)、分泌的影響及其相關(guān)分子機(jī)制。

8、　　方法:
　　采用改良的二步酶化法從從正常捐獻(xiàn)者眼球中分離人原代RPECs，以合適的細(xì)胞密度種板生長至融合。CCT分別為2954K和7378K的兩種復(fù)色白光LED以1500lux光照度，2h-開/20min-關(guān)的光照周期輻射刺激已融合的原代細(xì)胞。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)及實時熒光定量PCR(RT-qPCR)分別檢測VEGF-A，IL-6，IL-8及MCP-1蛋白分泌及基因表達(dá)變化。采用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測絲裂原活化蛋白

9、激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)，蛋白激酶B(Akt)，Janus激酶(Janus kinase，JAK)和核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear factor-κB，NF-κB)等信號通路在LED光刺激后的活化程度。采用氯甲基-2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(CM-H2DCFDA)檢測胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的水平。此外，抗氧化劑及信號通路的靶向分

10、子抑制劑用于進(jìn)一步研究相關(guān)機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　我們通過改良的酶化法成功地從捐獻(xiàn)者眼杯中分離出具有生長活性的原代RPECs，以適宜的種板密度使得原代細(xì)胞在體外生長融合后，仍保持了RPECs的上皮表型;分離培養(yǎng)的原代RPECs基礎(chǔ)狀態(tài)下具有旺盛的細(xì)胞因子分泌特征，顯著高于永生化ARPE-19細(xì)胞株;ELISA及RT-qPCR的結(jié)果顯示7378K LED白光刺激原代RPECs刺激后，VEGF-A，IL-6及IL-8蛋白分泌及基

11、因表達(dá)均顯著增高， MCP-1顯著降低，而2954K組未發(fā)生類似改變;信號通路分子的免疫印跡實驗顯示7378K LED白光可顯著激活MAPKs(ERK1/2， p38 MAPK及JNK1/2)及核蛋白NF-κB信號通路;機(jī)制分析提示:清除細(xì)胞內(nèi)ROS及靶向抑制MAPKs和NF-κB信號通路可顯著緩解7378K LED白光誘導(dǎo)的相關(guān)病理性細(xì)胞因子的變化。
　　結(jié)論:
　　高CCT的7378K LED白光可通過激活MAPKs及N

12、F-κB信號通路，造成人原代RPECs中VEGF-A，IL-6，IL-8及MCP-1的表達(dá)變化?？寡趸瘎┘癕APKs、NF-κB信號通路靶向分子抑制劑可顯著緩解LED白光誘導(dǎo)的相關(guān)病理細(xì)胞因子的變化。
　　第三部分 不同相關(guān)色溫的LED白光輻射對小鼠視網(wǎng)膜組織損傷及全基因組表達(dá)譜的影響
　　目的:
　　與傳統(tǒng)人工光源及日光光譜不同，如今普及使用的新型發(fā)光二極管(light-emitting diodes，LED)白光光

13、譜中具有一個強(qiáng)烈的短波藍(lán)光波峰。LED產(chǎn)生的高強(qiáng)度的藍(lán)光可能存在著對視網(wǎng)膜的潛在光毒性損傷，引起人們對其生物安全性的擔(dān)憂。通過優(yōu)化LED光譜可能有助于減少其造成的視網(wǎng)膜光毒性，本研究探討了不同相關(guān)色溫(correlated color temperature，CCT)的LED白光對小鼠視網(wǎng)膜組織損傷及視網(wǎng)膜組織全基因表達(dá)譜的影響。
　　方法:
　　正常10周齡雌性Babl/c小鼠暴露于CCT分別為2954K，5624K及73

14、78K的LED復(fù)色白光輻射下，以250、500、1000、3000lux光照度，刺激7天、14天及28天（光照周期為12小時-亮/12小時-暗）。在不同光照度及不同時間的LED白光輻射后，利用蘇木精伊紅(Hematein and Eosin，H&E)染色檢測視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)，原位末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）法檢測視網(wǎng)膜外核層(outer nuclear layer，ON

15、L)細(xì)胞凋亡，并采用小鼠視網(wǎng)膜Affymetrix GeneChip Mouse Genome4302.0全基因組表達(dá)譜芯片比較2954K及7378K兩種不同CCT的LED白光對小鼠視網(wǎng)膜基因表達(dá)的整體差異性。
　　結(jié)果:
　　H&E染色結(jié)果顯示:光輻射損傷導(dǎo)致小鼠的視網(wǎng)膜損傷主要表現(xiàn)為ONL變薄，細(xì)胞核數(shù)量減少。7378K LED白光，250lux刺激28天后， ONL細(xì)胞核數(shù)量顯著減少。而2954K LED白光直至光照度

16、提升至3000lux才導(dǎo)致小鼠ONL數(shù)量顯著下降，數(shù)量下降趨勢仍低于7378K組;在3000lux光照度刺激下，5624K組及7378K組小鼠ONL出現(xiàn)了顯著增多的TUNEL陽性細(xì)胞核，而在1000lux光照度刺激下，未觀察到顯著增多的陽性細(xì)胞;小鼠視網(wǎng)膜全基因表達(dá)譜芯片分析顯示:7378K與對照組比較中，121個基因表達(dá)上調(diào)，458個基因表達(dá)下調(diào)，而在2954K與對照組比較中，59個基因表達(dá)上調(diào)，僅4個基因表達(dá)下調(diào);對差異基因的GO和

17、KEGG富集分析，7378K組的差異表達(dá)基因，參與了341個相關(guān)Term/GO，16條相關(guān)Pathway;2954K組差異表達(dá)基因，參與12個Term/GO，7條相關(guān)Pathway。
　　結(jié)論:
　　LED白光對小鼠視網(wǎng)膜損傷呈現(xiàn)CCT依賴性，7378K LED白光更易造成小鼠視網(wǎng)膜損傷，顯著降低ONL細(xì)胞核數(shù)量，然而細(xì)胞凋亡途徑可能并非是唯一的損傷機(jī)制。小鼠視網(wǎng)膜表達(dá)譜芯片分析結(jié)果進(jìn)一步支持了2954K及7378K兩種不同