抑膈方對食管癌前病變Wnt信號通路相關蛋白表達及機制探討.pdf

1、目的:本實驗采用4-硝基喹啉-氧化物(4NQO)建立小鼠食管癌前病變模型，以抑膈方為觀察對象，以全反式維甲酸(ATRA)為陽性對照，觀察抑膈方對食管癌前病變相關指標的干預作用，探討抑膈方的部分機制。
　　方法:
　　分組:①正常組（20只），常規(guī)飼養(yǎng)。②模型組（30只），予4NQO誘癌，14周末造模成功，遂撤去4NQO。③陽性對照組（20只），造模成功后撤去4NQO，予0.1ml(0.15mg) ATRA溶液灌胃。④預防組(

2、30只)，4NQO誘癌同時予抑膈方灌胃，每周3次，每次灌胃0.1ml(含免煎顆粒0.084g)抑膈方溶液。造模成功后撤去4NQO，繼續(xù)灌胃。⑤治療組（30只），造模成功后撤去4NQO，予抑膈方灌胃，劑量同預防組。每周記錄各組小鼠體重1次，根據(jù)體重調整灌胃劑量。
　　24周末模型組小鼠出現(xiàn)癌變，全部處死小鼠，取14、24周末小鼠行HE染色，取24周末小鼠食管組織行透射電鏡、免疫組化、RT-PCR檢測。
　　結果:
　　1

3、觀察活體小鼠的一般狀況
　　于2周后，模型組個別小鼠飲食量下降，活動度減弱，10周末毛發(fā)無光澤，頸部脫毛，有時會見發(fā)抖樣，弓背卷縮;預防及治療組小鼠飲食量、活動度、毛發(fā)光澤度較陽性對照組好，且無脫毛現(xiàn)象;預防組小鼠較治療組精神狀態(tài)、活動度稍好。實驗過程中預防組死亡3只，模型組及陽性對照組、治療組各死亡2只。
　　2各組小鼠食管的大體觀察
　　將食管縱形剖開，14周末，正常組小鼠食管粘膜未見異常;模型組小鼠食管粘膜充血、

4、或灰暗，局部隆起，可見灰白斑點、斑塊。預防組小鼠食管粘膜色紅，未見灰白隆起及斑點、斑塊的形成。實驗末，正常組小鼠未見肉眼病變，模型組小鼠食管粘膜出現(xiàn)乳頭狀瘤，并可見潰瘍面形成。陽性對照組、預防組、治療組小鼠出現(xiàn)乳頭狀瘤，可見白色斑塊。
　　3光鏡下各組小鼠食管組織病理學觀察
　　正常組小鼠14、24周末食管上皮未見異常增生;模型組小鼠14周末異型細胞累及全層下2/3，24周末可見癌細胞，核大、深染，可見病理性核分裂;24周末

5、陽性對照組異型細胞大部分介于上皮全層的1/3-2/3;預防組14周末異型細胞不超過上皮全層的1/3，24周末組異型細胞累及上皮全層的1/3-2/3;治療組24周末異型細胞大部分超過上皮全層的2/3，少部分介于上皮全層的1/3-2/3。
　　4透射電鏡觀察各組食管細胞的亞顯微結構
　　模型組較正常組細胞間隙增寬，橋粒減少，細胞質水腫，染色質變異。陽性對照組、預防組、治療組較模型組細胞間隙稍緊密，橋粒較多;預防組、治療組較陽性對

6、照組細胞間隙寬、橋粒少;預防組較治療組細胞間隙緊密、橋粒豐富。
　　5免疫組化-SP法檢測各組β-catenin、Wnt1、c-myc蛋白的表達
　　β-catenin蛋白在正常組表達量少且主要為胞膜著色，在模型組中大量蓄積于胞漿及胞核，表現(xiàn)為胞質及胞核呈棕黃色。Wnt1蛋白在正常組表達水平低，在模型組中堆積于細胞質，表現(xiàn)為細胞質呈棕黃色。C-myc蛋白在正常組表達水平低，在模型組主要表達于細胞核，少量表達于細胞質，表現(xiàn)為細

7、胞核及細胞質呈棕黃色。β-catenin及c-myc在模型組表達水平明顯高于正常組(P＜0.05);陽性對照組、治療組、預防組明顯低于模型組(P＜0.05);預防組與陽性對照組無明顯差別（P＞0.05）;治療組高于陽性對照組(P＜0.05);預防組明顯低于治療組（P＜0.05）。Wnt1在模型組表達水平明顯高于正常組(P＜0.05);陽性對照組、治療組、預防組明顯低于模型組(P＜0.05);預防組、治療組高于陽性對照組(P＜0.05);

8、預防組與治療組無明顯差別（P＞0.05）。
　　6各組食管組織中β-catenin、Wnt1、c-myc基因的表達
　　各組總體RNA各等量利用Olig(dT)15錨定引物來進行逆轉錄，用β-catenin、Wnt1、c-myc引物對逆轉錄產物進行PCR擴增，分別出現(xiàn)192bp、623bp、263bp特異性擴增帶。其中模型組的擴增帶最亮，正常組最暗。陽性對照組、預防組、治療組與模型組相比，擴增帶較暗。β-catenin、Wn

9、t1、c-mycmRNA的表達水平用目的基因擴增片斷的積分吸光度與GAPDH擴增片斷的積分吸光度的比值表示。經統(tǒng)計學分析顯示:β-cateninmRNA/GAPDHmRNA、c-mycmRNA/GAPDHmRNA在模型組比值明顯高于正常組(P＜0.05);陽性對照組、治療組、預防組明顯低于模型組(P＜0.05);預防組與陽性對照組無明顯差別(P＞0.05);治療組高于陽性對照組（P＜0.05）;預防組明顯低于治療組(P＜0.05)。Wn

10、t1 mRNA/GAPDHmRNA在模型組比值明顯高于正常組(P＜0.05);陽性對照組、治療組、預防組明顯低于模型組(P＜0.05);預防組、治療組比值高于陽性對照組(P＜0.05);預防組與治療組無明顯差別(P＞0.05)。
　　結論:
　　14NQO為建立小鼠食管癌前病變動物模型的有效誘癌劑。
　　2隨著食管病理損害程度的加重，Wnt通路相關蛋白β-catenin、Wnt1、c-myc表達升高。
　　3抑膈