E-cadherin介導(dǎo)的麥冬皂苷B調(diào)控非小細(xì)胞肺癌Hippo通路的機(jī)制研究.pdf

1、[研究背景與目的]:
　　隨著對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)的逐步深入，靶向調(diào)控在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用的信號(hào)通路已在惡性腫瘤的治療中占據(jù)重要地位。Hippo信號(hào)通路是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的能夠協(xié)調(diào)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞死亡，調(diào)控細(xì)胞、組織生長(zhǎng)的一個(gè)高度保守的生長(zhǎng)控制信號(hào)通路。YAP和TAZ是其關(guān)鍵下游效應(yīng)分子，非磷酸化狀態(tài)的YAP可以轉(zhuǎn)移入核，與TEAD/TEF家族和其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的

2、作用，最終影響器官的大小以及腫瘤的形成。大量研究證實(shí)，Hippo通路在腫瘤進(jìn)程中扮演了重要角色?！爸苁峡私饚r方”（來(lái)自國(guó)醫(yī)大師周仲瑛教授）為臨床抗肺癌的有效驗(yàn)方。課題組前期對(duì)該方已經(jīng)展開(kāi)了系列的研究，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方能顯著抑制裸鼠移植瘤生長(zhǎng)。并且通過(guò)藥化分離及高通量平臺(tái)篩選，從該方中獲取到了一批細(xì)胞毒性成分。分析發(fā)現(xiàn)，麥冬皂苷類(lèi)化合物具有顯著地抗腫瘤效應(yīng)。針對(duì)抗癌效果較好的麥冬皂苷B（Ophiopogonin B，OP-B）做進(jìn)一

3、步研究，分析發(fā)現(xiàn)其對(duì)Hippo通路的交叉網(wǎng)絡(luò)有顯著調(diào)節(jié)作用。因此，本研究試圖發(fā)現(xiàn)和闡明OP-B在調(diào)控Hippo通路及其系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)的作用，為其臨床腫瘤治療提供強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　[實(shí)驗(yàn)內(nèi)容]:
　　本文以發(fā)病率及死亡率居首位的非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)為病理模型，剖析OP-B對(duì)Hippo通路的調(diào)控作用。第一部分以YAP為指標(biāo)考察OP-B對(duì)Hippo通路是否有調(diào)節(jié)作用。第二

4、部分對(duì)可能與OP-B作用相關(guān)的Hippo通路的交叉網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，最終選擇E-cadherin及其相關(guān)連接蛋白進(jìn)行研究，利用Westernblot、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)及siRNA干擾等技術(shù)探究其在OP-B調(diào)節(jié)YAP、發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)中的關(guān)系。第三部分則通過(guò)siRNA干擾實(shí)驗(yàn)和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)最終驗(yàn)證了Hippo通路在OP-B發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)中的重要地位。
　　[研究結(jié)果]:
　　第一部分:我們利用Westernblot檢測(cè)

5、藥物對(duì)YAP和p-YAP(Ser127)蛋白表達(dá)的作用，發(fā)現(xiàn)OP-B能劑量依賴(lài)性地促進(jìn)YAP的Ser127磷酸化蛋白的生成。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)OP-B能降低YAP入核細(xì)胞百分比。說(shuō)明OP-B能抑制YAP的活化，促進(jìn)YAP的Ser127磷酸化，限制YAP的入核。第二部分:為了研究E-cadherin是否參與OP-B的抗腫瘤作用的發(fā)揮，我們分別通過(guò)誘導(dǎo)E-cadherin的表達(dá)和抑制E-cadherin的功能后檢測(cè)OP-B對(duì)細(xì)胞活力

6、的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)E-cadherin的合成，OP-B對(duì)NCI-H460細(xì)胞增殖能力的抑制作用增強(qiáng)，而抑制E-cadherin的功能明顯削弱了OP-B對(duì)NCI-H460細(xì)胞增殖能力的抑制作用。說(shuō)明E-cadherin參與OP-B的抑制細(xì)胞增殖作用。而且發(fā)現(xiàn)OP-B能劑量依賴(lài)性地促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)，抑制β-catenin的表達(dá)，但是對(duì)α-catenin蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯作用。進(jìn)一步通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)、β-catenin s

7、iRNA干擾實(shí)驗(yàn)等發(fā)現(xiàn)，OP-B劑量依賴(lài)性地促進(jìn)β-catenin與E-cadherin的結(jié)合;干擾β-catenin蛋白的表達(dá)后，YAP的Ser127磷酸化水平明顯降低，YAP核內(nèi)大量聚積，且阻斷了OP-B的促進(jìn)YAP磷酸化的作用。第三部分:通過(guò)LATS1 siRNA干擾實(shí)驗(yàn)和構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)YAP細(xì)胞株檢測(cè)OP-B對(duì)YAP及NCI-H460細(xì)胞活力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與干擾β-catenin的表達(dá)效應(yīng)類(lèi)似，干擾LATS1蛋白的表達(dá)后，阻斷

8、了OP-B的促進(jìn)YAP磷酸化的作用，且過(guò)表達(dá)YAP削弱了OP-B的抑制細(xì)胞增殖作用。進(jìn)一步驗(yàn)證了Hippo通路在OP-B發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)中的重要作用。
　　[結(jié)論與意義]:
　　本研究結(jié)果表明，OP-B通過(guò)促進(jìn)β-catenin與E-cadherin的結(jié)合，傳遞調(diào)控Hippo通路的信號(hào)，抑制YAP的活化，使其滯留在細(xì)胞質(zhì)中，限制其核內(nèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、抗腫瘤作用。研究中我們探討了E-cadherin與Hip