E-cadherin介導的麥冬皂苷B調(diào)控非小細胞肺癌Hippo通路的機制研究.pdf

1、[研究背景與目的]:
　　隨著對腫瘤發(fā)病機制認識的逐步深入，靶向調(diào)控在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用的信號通路已在惡性腫瘤的治療中占據(jù)重要地位。Hippo信號通路是近年來研究發(fā)現(xiàn)的能夠協(xié)調(diào)細胞增殖、細胞分化和細胞死亡，調(diào)控細胞、組織生長的一個高度保守的生長控制信號通路。YAP和TAZ是其關鍵下游效應分子，非磷酸化狀態(tài)的YAP可以轉移入核，與TEAD/TEF家族和其他轉錄因子相互作用來調(diào)節(jié)靶基因的轉錄表達，發(fā)揮促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的

2、作用，最終影響器官的大小以及腫瘤的形成。大量研究證實，Hippo通路在腫瘤進程中扮演了重要角色。“周氏克金巖方”（來自國醫(yī)大師周仲瑛教授）為臨床抗肺癌的有效驗方。課題組前期對該方已經(jīng)展開了系列的研究，動物實驗結果顯示，該方能顯著抑制裸鼠移植瘤生長。并且通過藥化分離及高通量平臺篩選，從該方中獲取到了一批細胞毒性成分。分析發(fā)現(xiàn)，麥冬皂苷類化合物具有顯著地抗腫瘤效應。針對抗癌效果較好的麥冬皂苷B（Ophiopogonin B，OP-B）做進一

3、步研究，分析發(fā)現(xiàn)其對Hippo通路的交叉網(wǎng)絡有顯著調(diào)節(jié)作用。因此，本研究試圖發(fā)現(xiàn)和闡明OP-B在調(diào)控Hippo通路及其系統(tǒng)網(wǎng)絡的作用，為其臨床腫瘤治療提供強有力的實驗依據(jù)。
　　[實驗內(nèi)容]:
　　本文以發(fā)病率及死亡率居首位的非小細胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)為病理模型，剖析OP-B對Hippo通路的調(diào)控作用。第一部分以YAP為指標考察OP-B對Hippo通路是否有調(diào)節(jié)作用。第二

4、部分對可能與OP-B作用相關的Hippo通路的交叉網(wǎng)絡進行分析，最終選擇E-cadherin及其相關連接蛋白進行研究，利用Westernblot、細胞免疫熒光技術、免疫共沉淀實驗及siRNA干擾等技術探究其在OP-B調(diào)節(jié)YAP、發(fā)揮抗腫瘤效應中的關系。第三部分則通過siRNA干擾實驗和過表達實驗最終驗證了Hippo通路在OP-B發(fā)揮抗腫瘤效應中的重要地位。
　　[研究結果]:
　　第一部分:我們利用Westernblot檢測

5、藥物對YAP和p-YAP(Ser127)蛋白表達的作用，發(fā)現(xiàn)OP-B能劑量依賴性地促進YAP的Ser127磷酸化蛋白的生成。細胞免疫熒光實驗結果也發(fā)現(xiàn)OP-B能降低YAP入核細胞百分比。說明OP-B能抑制YAP的活化，促進YAP的Ser127磷酸化，限制YAP的入核。第二部分:為了研究E-cadherin是否參與OP-B的抗腫瘤作用的發(fā)揮，我們分別通過誘導E-cadherin的表達和抑制E-cadherin的功能后檢測OP-B對細胞活力

6、的影響。結果發(fā)現(xiàn)，誘導E-cadherin的合成，OP-B對NCI-H460細胞增殖能力的抑制作用增強，而抑制E-cadherin的功能明顯削弱了OP-B對NCI-H460細胞增殖能力的抑制作用。說明E-cadherin參與OP-B的抑制細胞增殖作用。而且發(fā)現(xiàn)OP-B能劑量依賴性地促進E-cadherin的表達，抑制β-catenin的表達，但是對α-catenin蛋白表達水平無明顯作用。進一步通過免疫共沉淀實驗、β-catenin s

7、iRNA干擾實驗等發(fā)現(xiàn)，OP-B劑量依賴性地促進β-catenin與E-cadherin的結合;干擾β-catenin蛋白的表達后，YAP的Ser127磷酸化水平明顯降低，YAP核內(nèi)大量聚積，且阻斷了OP-B的促進YAP磷酸化的作用。第三部分:通過LATS1 siRNA干擾實驗和構建穩(wěn)定高表達YAP細胞株檢測OP-B對YAP及NCI-H460細胞活力的影響，結果發(fā)現(xiàn)與干擾β-catenin的表達效應類似，干擾LATS1蛋白的表達后，阻斷

8、了OP-B的促進YAP磷酸化的作用，且過表達YAP削弱了OP-B的抑制細胞增殖作用。進一步驗證了Hippo通路在OP-B發(fā)揮抗腫瘤效應中的重要作用。
　　[結論與意義]:
　　本研究結果表明，OP-B通過促進β-catenin與E-cadherin的結合，傳遞調(diào)控Hippo通路的信號，抑制YAP的活化，使其滯留在細胞質(zhì)中，限制其核內(nèi)相關基因的轉錄，從而發(fā)揮抑制細胞生長、抗腫瘤作用。研究中我們探討了E-cadherin與Hip