產(chǎn)酶溶桿菌C3菌株多環(huán)四胺酸大環(huán)內(nèi)酰胺類化合物的分離與抗真菌作用機(jī)制研究.pdf

1、隨著放射療法、化學(xué)療法、免疫抑制劑、抗生素和內(nèi)置醫(yī)療器械的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致了發(fā)生嚴(yán)重的感染，尤其是真菌感染。其中，白色念珠菌在免疫低下的病人體內(nèi)成為最易感染的真菌，也是許多重大疾病導(dǎo)致死亡的直接原因。治療白色念珠菌感染需要長(zhǎng)期大量地使用藥物，導(dǎo)致耐藥菌不斷出現(xiàn)，加劇了臨床治療的難度。發(fā)現(xiàn)新結(jié)構(gòu)和新作用機(jī)制的抗真菌藥物，是控制白色念珠菌感染的重要途徑。
　　具有活性的化合物大部分來(lái)源于微生物。長(zhǎng)期以來(lái)人們主要關(guān)注革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌來(lái)源

2、的活性天然產(chǎn)物，而革蘭氏陰性細(xì)菌蘊(yùn)藏的豐富天然產(chǎn)物資源沒(méi)有得到應(yīng)有的關(guān)注。近些年人們對(duì)溶桿菌的開發(fā)，得到了系列結(jié)構(gòu)新穎的活性化合物，溶桿菌正成為活性天然產(chǎn)物的新資源。本學(xué)位論文對(duì)產(chǎn)酶溶桿菌C3菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行篩選，在其次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離得到了4個(gè)多環(huán)四胺酸大環(huán)內(nèi)酰胺(PTM)類化合物;開展了2個(gè)PTM類化合物的體內(nèi)外抗真菌活性評(píng)價(jià)，探討了其抗真菌的作用機(jī)制。
　　本論文第一章概述了當(dāng)前真菌感染的嚴(yán)重性和臨床抗真菌藥物品種的匱乏。

3、實(shí)際上，目前臨床抗真菌藥物的作用靶點(diǎn)主要集中在細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，并且導(dǎo)致大量耐藥菌株的出現(xiàn)。從新資源溶桿菌中尋找新穎的抗真菌化合物，是一條行之有效的途徑。本章綜述了溶桿菌活性天然產(chǎn)物及其生物活性和生物合成的研究現(xiàn)狀。
　　本論文第二章是產(chǎn)酶溶桿菌C3菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化，對(duì)該菌株中得到的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。產(chǎn)酶溶桿菌C3菌株的平板發(fā)酵培養(yǎng)基篩選結(jié)果表明，C3菌株在TSB培養(yǎng)基中次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量最高。同時(shí)我們對(duì)TSB的用量進(jìn)行

4、考察，發(fā)現(xiàn)隨著TSB用量的減少，在C3菌株中得到的產(chǎn)物的量也相應(yīng)降低。最終我們選用1/10 TSB培養(yǎng)基進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵，得到4個(gè)PTM類化合物。其中，3個(gè)已知化合物（HSAF、3-deOH-HSAF和3-deOH-alteramide B）和1個(gè)新化合物alteramide B(ATB)。
　　本論文第三章是HSAF抑制絲狀真菌和白色念珠菌的活性研究。首先以水稻稻瘟病菌為研究模型，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組差異分析，發(fā)現(xiàn)HSAF對(duì)細(xì)胞的凋亡途徑有

5、重要影響。由于細(xì)胞壁具有成分比較復(fù)雜的外層和結(jié)構(gòu)比較致密的內(nèi)層結(jié)構(gòu)，能夠影響小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。我們研究在給藥過(guò)程中小分子藥物對(duì)于細(xì)胞各組分起到的作用及其作用機(jī)制，其中首要的是獲得原生質(zhì)體，進(jìn)而以白色念珠菌為模型，在原生質(zhì)體水平，考察了HSAF作用方式。利用DCFH-DA熒光染色，檢測(cè)HSAF作用后細(xì)胞內(nèi)的活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平。加入四種活性氧清除劑:抗壞血酸(AA)、硫脲(TU)、乙

6、酰半胱氨酸(NAC)和谷胱甘肽(GSH)后，HSAF的抗真菌活性明顯降低，表明HSAF通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS上調(diào)抑制真菌生長(zhǎng)。通過(guò)熒光倒置顯微鏡、流式細(xì)胞分析儀和westernblotting等檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HSAF引起線粒體膜發(fā)生變化，其電位呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，引起DNA損傷和細(xì)胞周期分布異常，停留在G2/M期，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生早期和晚期凋亡。
　　本論文第四章是新化合物ATB抗白色念珠菌的作用機(jī)制研究。ATB對(duì)白念珠菌的體外抑制較好，

7、不僅能抑制白念珠菌酵母態(tài)的生長(zhǎng)，也能抑制其菌絲體的生長(zhǎng)。ATB能夠誘導(dǎo)白色念珠菌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的上升，引起細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ATB能夠引起白色念珠菌細(xì)胞G2/M期停滯，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生早期和晚期凋亡。AA可以抑制ATB對(duì)白色念珠菌細(xì)胞的生長(zhǎng)周期阻滯和凋亡誘導(dǎo)作用，因此，ATB通過(guò)誘導(dǎo)白色念珠菌細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和積累而發(fā)揮其抗真菌活性。作用靶點(diǎn)研究結(jié)果表明，在HeLa細(xì)胞中，ATB能夠與微管蛋白結(jié)合;在體外，ATB

8、能夠抑制微管蛋白的聚集;分子模擬表明，ATB能與白色念珠菌β-tubulin的12個(gè)關(guān)鍵氨基酸相互作用;點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，ATB與β-tubulin的可能結(jié)合位點(diǎn)分別為L(zhǎng)215、L217、L273、T274和R282，其中R282是關(guān)鍵作用位點(diǎn)。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ATB發(fā)揮了良好的體內(nèi)抑制白色念珠菌的作用。
　　本論文研究發(fā)現(xiàn)了新化合物ATB，探討了其抗真菌作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制，首次發(fā)現(xiàn)微管蛋白有望成為抗真菌藥物的新靶點(diǎn)，為臨