前胡質(zhì)量評(píng)價(jià)方法及呋喃香豆素類同分異構(gòu)體質(zhì)譜分析方法研究.pdf

1、前胡為傘形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn的干燥根?！吨袊?guó)藥典》記載前胡有降氣化痰、散風(fēng)清熱的功效，用于痰熱喘滿，咳痰黃稠，風(fēng)熱咳嗽痰多等癥。香豆素類化合物是前胡中的主要化學(xué)成分，包括角型吡喃香豆素、呋喃香豆素和其他香豆素，是前胡質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。目前對(duì)前胡的質(zhì)量研究集中在化學(xué)成分的定性分析，或?qū)ι贁?shù)香豆素成分進(jìn)行定量分析，尚缺乏對(duì)前胡藥材中香豆素類化合物進(jìn)行全面鑒定和定量分析的方法。本研究針對(duì)前

2、胡質(zhì)量評(píng)價(jià)中存在的問(wèn)題進(jìn)行了以下兩方面研究：1采用超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（UHPLC-Q-TOF-MS/MS），建立了前胡中香豆素類成分同時(shí)鑒定和定量的分析方法，并對(duì)不同前胡樣品和混淆品進(jìn)行比較。2依據(jù)《歐洲藥典》起草了前胡的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。包括性狀，粉末顯微鑒別，薄層色譜法鑒別，水分、總灰分和酸不溶性灰分的檢查，白花前胡甲素和白花前胡乙素的高效液相色譜法含量測(cè)定。
　　呋喃香豆素類化合物廣泛分布于高等植物中，其基本骨架由苯

3、并?吡喃酮和呋喃環(huán)構(gòu)成，分為線型和角型兩種，并常以C-5位和C-8位不同取代的同分異構(gòu)體形式共存。由于同分異構(gòu)體具有分子量相同、結(jié)構(gòu)相近和理化性質(zhì)相似等特點(diǎn)，通常具有相似的色譜行為和質(zhì)譜裂解特征而不易區(qū)分。本文采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，通過(guò)研究4對(duì)呋喃香豆素同分異構(gòu)體，總結(jié)了特征碎片離子的相對(duì)豐度比法（RRA）用以區(qū)分C-5位和C-8位不同取代的同分異構(gòu)體，并將此方法用于白芷中呋喃香豆素同分異構(gòu)體的區(qū)分，為中藥復(fù)雜體系

4、中異構(gòu)體的研究提供了新思路。
　　第一部分前胡中香豆素類化合物同時(shí)鑒定和定量分析方法的建立及其在前胡與混淆品分析中的應(yīng)用
　　目的：采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，建立同時(shí)鑒定和定量分析前胡中香豆素類成分的方法，并評(píng)價(jià)不同前胡樣品和混淆品的質(zhì)量。
　　方法：
　　1.檢測(cè)條件：采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。色譜柱為Thermo Hypersil GOLD（100 mm×2.

5、1 mm，3μm），流動(dòng)相為1 mmol/L乙酸銨水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脫，流速為0.5 mL/min；進(jìn)樣量5μL。高分辨質(zhì)譜采用ESI源，正離子模式，一級(jí)全掃描采集，采用動(dòng)態(tài)背景扣除和信息依賴采集觸發(fā)二級(jí)碎片的采集，每一循環(huán)采集12個(gè)最強(qiáng)峰的二級(jí)質(zhì)譜圖。
　　2.樣品制備：甲醇作為提取溶劑，采用超聲處理的方式制備樣品。
　　3.化合物鑒定和定量分析：將已知的化學(xué)式輸入數(shù)據(jù)處理軟件MasterView中，對(duì)誤差范

6、圍在±5 ppm內(nèi)的色譜峰基于精確分子質(zhì)量和一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖，結(jié)合香豆素的裂解規(guī)律和文獻(xiàn)中已報(bào)道的化合物的裂解途徑進(jìn)行鑒定；在進(jìn)行鑒定的同一分析周期內(nèi)，對(duì)有對(duì)照品的9個(gè)成分白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E、歐前胡素、異歐前胡素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、補(bǔ)骨脂素和異茴芹內(nèi)酯進(jìn)行絕對(duì)定量，對(duì)所有色譜峰得到專屬分離的化合物采用峰面積進(jìn)行相對(duì)量測(cè)定。
　　4.樣品分析：以對(duì)照藥材中各定量化合物的峰面積為標(biāo)準(zhǔn)，其他樣品中各化合物峰面積

7、與之比較，產(chǎn)生峰面積比值，基于峰面積比值的和及主成分分析法對(duì)23批前胡樣品進(jìn)行分析。依據(jù)已鑒定的化合物對(duì)13批前胡混淆品進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：應(yīng)用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析鑒定了前胡中54個(gè)香豆素類化合物，包括36個(gè)角型吡喃香豆素、13個(gè)呋喃香豆素和5個(gè)其他香豆素。其中色譜峰得到專屬分離的化合物共29個(gè)。9種成分在測(cè)定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，儀器重復(fù)性、檢測(cè)限、定量限、精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性均符合要求。9種化學(xué)成分

8、在所有批次樣品中的總含量范圍為694.57~26532.10μg/g，RSD值為51％。29個(gè)化合物中有8個(gè)角型吡喃香豆素和2個(gè)呋喃香豆素的峰面積在樣品中較大。PCA分析結(jié)果表明前胡香豆素E、白花前胡甲素和3'-（異戊酰氧基/2-甲基丁酰氧基）-4'-（異戊酰氧基/2-甲基丁酰氧基）凱爾消旋內(nèi)酯的含量是評(píng)價(jià)前胡藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素。對(duì)13批前胡混淆品的分析結(jié)果表明紫花前胡、少毛北前胡、毛前胡和石防風(fēng)具有與白花前胡一定相同的物質(zhì)基礎(chǔ)，且可以

9、分別利用15、13、14和31個(gè)香豆素成分區(qū)分白花前胡與紫花前胡、少毛北前胡、毛前胡和石防風(fēng)。前胡混淆品隔山香不具有與白花前胡相似的物質(zhì)基礎(chǔ)。前胡已鑒定的54個(gè)化合物中有8個(gè)化合物（6個(gè)角型吡喃香豆素、1個(gè)呋喃香豆素和1個(gè)其他香豆素）均不存在于13批混淆品中。
　　結(jié)論：本研究首次建立了同一分析周期內(nèi)同時(shí)鑒定和定量分析前胡中香豆素成分的UHPLC-Q-TOF-MS/MS法。該法簡(jiǎn)便、靈敏度高、專屬性強(qiáng)。對(duì)前胡樣品和前胡混淆品的分析

10、可知角型吡喃香豆素是評(píng)價(jià)前胡質(zhì)量的關(guān)鍵，且能用于區(qū)分前胡及其混淆品。
　　第二部分前胡質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究
　　目的：建立前胡質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，為《歐洲藥典》前胡質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供參考。
　　方法：以9批樣品為分析對(duì)象，探索前胡質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。
　　1.鑒別：采用性狀鑒別、顯微鑒別和薄層色譜鑒別法。觀察前胡的外觀性狀及其粉末在顯微鏡下的特征；薄層色譜鑒別法以甲醇作為提取溶劑，超聲處理的方法制備樣品，使用硅膠G薄層板，以環(huán)己烷-

11、乙酸乙酯（2:1）為展開(kāi)劑，紫外光燈（365 nm）下檢視。
　　2.檢查：依據(jù)《歐洲藥典》中的檢查方法對(duì)前胡進(jìn)行水分、總灰分和酸不溶性灰分的檢查。
　　3.含量測(cè)定：采用高效液相色譜法測(cè)定白花前胡甲素和白花前胡乙素兩成分。以甲醇作為提取溶劑，超聲處理時(shí)間為30分鐘，提取液直接測(cè)定分析。采用Thermo ODS HYPERSIL色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），以甲醇-水（68:32）為流動(dòng)相，流速0.8 mL/

12、min，進(jìn)樣體積10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)322 nm。
　　結(jié)果：
　　1.鑒別：前胡外觀性狀突出，具有特征性的縱溝、縱皺紋及橫向皮孔樣突起；前胡粉末顯微特征突出，具有特征性的木栓細(xì)胞、導(dǎo)管和木纖維；薄層色譜法可見(jiàn)7個(gè)熒光斑點(diǎn)。
　　2.檢查：9批樣品的含水量均小于8.9%，總灰分均小于7.8%，酸不溶性灰分均小于3.4%。
　　3.含量測(cè)定：白花前胡甲素和白花前胡乙素分別在5.00~400.00μg/mL和0.50~

13、40.00μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程分別為 Y=28.4782224X+6.484094（r=0.99999）和Y=25.5893187X-0.3288223（r=0.99999），精密度（RSD）均在0.6%~2.0%之間，加樣回收率均在90.7%~104.8%之間。白花前胡甲素的含量范圍為0.73%~2.24%，白花前胡乙素的含量范圍為0.12%~0.33%。
　　結(jié)論：本文建立的鑒別、檢查和含量測(cè)定方法穩(wěn)定，更簡(jiǎn)

14、便，可用于前胡的質(zhì)量控制。
　　第三部分 UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)區(qū)分呋喃香豆素類同分異構(gòu)體及其在白芷中的應(yīng)用
　　目的：建立一種快速、穩(wěn)定的區(qū)分C-5位和C-8位不同取代的呋喃香豆素類同分異構(gòu)體的質(zhì)譜方法，并將其應(yīng)用于白芷中呋喃香豆素類同分異構(gòu)體的鑒定。
　　方法：采用 UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)中的 MS-IDA-12MS/MS模式和子離子掃描模式對(duì)4對(duì)同分異構(gòu)體，花椒毒素和佛手柑內(nèi)酯、歐

15、前胡素和異歐前胡素、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素、茴芹內(nèi)酯和異茴芹內(nèi)酯進(jìn)行采集，使用 MasterView軟件對(duì)其碎裂規(guī)律和碎片信息進(jìn)行總結(jié)和分析，建立呋喃香豆素類同分異構(gòu)體的質(zhì)譜區(qū)分方法，并對(duì)白芷中的呋喃香豆素類同分異構(gòu)體進(jìn)行鑒定區(qū)分。采用Epic C18色譜柱（15 cm×2.1 mm，3μm），流動(dòng)相為1 mmol/L乙酸銨水溶液（A）和甲醇（B），梯度洗脫。
　　結(jié)果：建立特征碎片離子的相對(duì)豐度比法（RRA）用于C-5位和C-8位