青蒿琥酯對(duì)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后血腦屏障的保護(hù)及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage，SAH)主要發(fā)生于相對(duì)年輕的人群，其導(dǎo)致的高死殘率對(duì)社會(huì)和家庭造成了巨大的損失。目前認(rèn)為，SAH的病理生理機(jī)制主要涉及腦神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包含腦內(nèi)大血管下游所有的小血管以及與這些血管相關(guān)的所有細(xì)胞。血腦屏障(Blood-brain barrier，BBB)是神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)中最為重要的結(jié)構(gòu)之一，它的損傷與SAH后發(fā)生的血管性腦水腫有著極為緊密的聯(lián)系。因此，保

2、護(hù)BBB免受損傷將有助于SAH病人的康復(fù)。
　　青蒿琥酯，作為半合成水溶性的青蒿素衍生物，已經(jīng)成為腦型瘧疾和其他各種重型瘧疾的標(biāo)準(zhǔn)治療藥物。青蒿琥酯的抗瘧作用高效、安全且耐受良好。而且，大量的研究也指出，其具有廣泛的藥理學(xué)活性，例如抗寄生蟲、抗腫瘤、抗炎和抗微生物等。神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生涉及多種病因和復(fù)雜的病理生理機(jī)制。近來的研究也顯示單一作用機(jī)制和具有嚴(yán)重副作用的藥物不可能用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。因此，具有多種作用效應(yīng)的青蒿琥酯可能

3、在預(yù)防和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面具有重要的應(yīng)用潛力。更為重要的是，青蒿琥酯能特異性地在腦組織中保持高濃度。新近研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯能夠緩解小鼠實(shí)驗(yàn)性腦型瘧疾導(dǎo)致的BBB損傷，而且這種緩解與瘧原蟲的殺滅無關(guān)。另外，F(xiàn)TY720（S1P1的激動(dòng)劑）聯(lián)合青蒿琥酯治療小鼠腦型瘧疾可以明顯減輕BBB的損傷并提高其存活率。因此，有理由相信青蒿琥酯對(duì)SAH具有治療作用。
　　1-磷酸鞘氨醇受體-1(Sphingosine-1-phosphate re

4、ceptor-1，S1PO主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞上。S1P1特異性地與Gi/o家族結(jié)合，在維持血流依賴性血管網(wǎng)絡(luò)方面具有重要的作用。在小鼠體內(nèi)全部或僅內(nèi)皮細(xì)胞上敲除S1P1基因都會(huì)對(duì)血管叢產(chǎn)生極為嚴(yán)重的后果。以往的研究指出，激活S1P1可保護(hù)多種卒中模型導(dǎo)致的腦損傷，如:增加S1P的表達(dá)可以提高S1P1的活性，進(jìn)而阻止SAH后小鼠早期腦損傷的發(fā)展。但是，對(duì)S1P1在保護(hù)受損腦組織中涉及的下游信號(hào)通路并沒有完全弄清。研究顯示，S1P1既可

5、通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路抑制凋亡、阻止FoxO3a活化并最終促進(jìn)PC12細(xì)胞的存活;也可使心肌細(xì)胞在缺氧條件下存活;還可促進(jìn)脂肪干細(xì)胞分化成為表達(dá)內(nèi)皮型NO合酶的內(nèi)皮樣細(xì)胞等。因此，PI3K是S1P1分子一個(gè)極為重要的下游效應(yīng)器。而且，Taddei等人發(fā)現(xiàn)激活PI3K/Akt分子可以滅活GSK-3β并阻止β-catenin的核轉(zhuǎn)位，這樣有利于解除其對(duì)Claudin-5表達(dá)的抑制并最終增加Claudin-5的表達(dá)。類似研究也指出，

6、小鼠腦出血后激活PI3K/Akt信號(hào)通路可以減少GSK-3β的激活并穩(wěn)定β-catenin，最終增加緊密連接蛋白Claudin-3和Claudin-5的表達(dá)。眾所周知，緊密連接蛋白Claudin-3和Claudin-5對(duì)維護(hù)BBB的完整性極為重要。高效地促進(jìn)Claudin-3和Claudin-5的表達(dá)，可以有效地緩解各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的BBB損傷。
　　基于上述研究成果，推測(cè)SAH后給予青蒿琥酯可以激活S1P1進(jìn)而保護(hù)BBB

7、的完整性。利用腦血管內(nèi)穿法來構(gòu)建SAH大鼠模型，進(jìn)而研究SAH后青蒿琥酯對(duì)BBB的保護(hù)效應(yīng)和潛在機(jī)制。
　　方法：
　　整個(gè)課題研究包括在體和離體實(shí)驗(yàn)兩部分。腦血管內(nèi)穿法被用于構(gòu)建大鼠SAH模型。
　　1、18分SAH分級(jí)評(píng)分法被用于評(píng)價(jià)大鼠SAH后24和72小時(shí)的出血量，以此來判斷模型構(gòu)建成功與否。
　　2、改良Garcia神經(jīng)功能評(píng)分被用于檢測(cè)大鼠SAH后24和72小時(shí)的神經(jīng)系統(tǒng)功能。
　　3、腦水腫程

8、度則通過檢測(cè)大鼠SAH后24和72小時(shí)的腦水含量來進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　4、血腦屏障完整性則通過檢測(cè)大鼠SAH后24小時(shí)腦組織的伊文斯藍(lán)滲出量、伊文斯藍(lán)的自發(fā)熒光以及透射電鏡來進(jìn)行評(píng)估。
　　5、大鼠SAH后24小時(shí)S1P1表達(dá)量則通過免疫組化染色來進(jìn)行檢測(cè)。
　　6、Western blot被用于檢測(cè)大鼠SAH后24或72小時(shí)，S1P1、 SphK1、SphK2、p-Akt/Akt、 p-GSK3β/GSK3β、 p-β-

9、Catenin/β-Catenin、 Claudin-3和Claudin-5蛋白的表達(dá)情況。此外，離體實(shí)驗(yàn)中，S1P1的表達(dá)量也使用Western blot來檢測(cè)。
　　7、CCK-8被用于檢測(cè)大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞在給予青蒿琥酯24小時(shí)后的活性。
　　8、在體實(shí)驗(yàn)中，siRNA的抑制效果則使用RT-PCR來進(jìn)行評(píng)估。
　　9、自發(fā)性高血壓大鼠血壓的測(cè)定，則使用MRBP血壓測(cè)量?jī)x在2％高鹽溶液給予后，每周檢測(cè)一次。

10、　　10、SAH后24或72小時(shí)，青蒿琥酯的治療作用通過神經(jīng)功能評(píng)分、腦水含量、伊文斯藍(lán)滲出量、伊文斯藍(lán)自發(fā)熒光和透射電鏡進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　11、青蒿琥酯對(duì)SAH后BBB保護(hù)涉及的具體分子機(jī)制，則通過分別給予不同拮抗劑(如DMS，VPC23019和Wortmannin)和siRNA(如S1P1 siRNA和Scr siRNA)進(jìn)行確認(rèn)。
　　12、青蒿琥酯的預(yù)防作用則通過檢測(cè)SAH后24小時(shí)，大鼠的神經(jīng)功能、腦水含量、以及伊文

11、斯藍(lán)滲出量來評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果：
　　1、相對(duì)高濃度的青蒿琥酯(100mg/kg，200mg/kg)可以有效地緩解SAH后模型大鼠的神經(jīng)功能缺損、抑制腦水腫并減輕BBB的損傷。
　　2、青蒿琥酯在在體和離體實(shí)驗(yàn)中，均能明顯增加S1P1的表達(dá)。但對(duì)神經(jīng)鞘氨醇激酶SphK1和SphK2的表達(dá)則沒有影響，而且給予神經(jīng)鞘氨醇激酶抑制劑N，N-dimethylsphingosine，并不能逆轉(zhuǎn)青蒿琥酯的作用。
　　3、200

12、mg/kg青蒿琥酯可以提高SAH24h后蛋白分子p-Akt、Claudin-3和Claudin-5的表達(dá)，并降低p-GSK-3/GSK-3β和p-β-catenin/β-catenin的比率。青蒿琥酯的這些作用可以被VPC23019、wortmannin和S1P1 siRNA所逆轉(zhuǎn)。
　　4、預(yù)先給予200mg/kg青蒿琥酯，并不能提高SAH后24h模型大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分，而且腦水含量和伊文斯藍(lán)的滲出量也未明顯減少。但預(yù)防性給予青

13、蒿琥酯，可以明顯減輕自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)慢性高血壓導(dǎo)致的BBB損傷。
　　結(jié)論：
　　1、青蒿琥酯可以通過維護(hù)血腦屏障完整性進(jìn)而減少腦水腫，來緩解SAH導(dǎo)致的腦損傷。因其可顯著提高S1P1表達(dá)量，而對(duì)神經(jīng)鞘氨醇激酶SphK1和SphK2表達(dá)的影響則不大，所以，此作用可能與提高S1P的濃度無關(guān)。
　　2、S1P1與PI3K信號(hào)通路關(guān)系密切，S1P1激活能夠增加PI3K/Akt的活性，進(jìn)而滅活GSK-3β并穩(wěn)定β-c