黑曲霉硫氧還蛋白體系基因的克隆、鑒定、融合及其在食品工程中的應(yīng)用.pdf

1、黑曲霉(Aspetgillus niger)是一種模式真菌和重要的工業(yè)微生物。硫氧還原蛋白系統(tǒng)中包含硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)和硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin reductase，TrxR)以及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)，與谷胱甘肽系統(tǒng)共同構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)的氧化還原系統(tǒng)。由于Trx體系可還原二硫鍵，如大腸桿菌(Esche

2、richia coli)中的Trx體系可降低食物中二硫鍵引起的變應(yīng)原反應(yīng)。本研究首先克隆并鑒定了黑曲霉Trx體系中的硫氧還蛋白(AnTrx)和硫氧還蛋白還原酶(AnTrxR)基因，并對(duì)AnTrx的保守區(qū)域進(jìn)行位點(diǎn)突變分析。在此基礎(chǔ)上利用基因重疊延伸技術(shù)(SOE)，用兩種不同的融合肽，將兩個(gè)蛋白進(jìn)行融合。并就融合表達(dá)的Trx體系和獨(dú)立表達(dá)的Trx體系進(jìn)行比較分析。最后，提取麥醇溶蛋白，并將Trx體系和麥醇溶蛋白進(jìn)行孵育，分析其對(duì)麥醇溶蛋白

3、中二硫鍵的還原情況。
　　 AnTrx的克隆表達(dá)與保守位點(diǎn)突變首次從黑曲霉全基因組中克隆出黑曲霉硫氧還原蛋白基因AnTrx，并對(duì)其第33～37位保守區(qū)的活性位點(diǎn)實(shí)施定點(diǎn)突變C34S、C37S及C34S-C37S，獲得相應(yīng)的三個(gè)定點(diǎn)突變基因。將野生型AnTrx及其突變子分別在E.coli中誘導(dǎo)表達(dá)，比濁法測(cè)定純化的各表達(dá)產(chǎn)物還原牛胰島素α與β鏈之間二硫鍵的活性。結(jié)果表明，AnTrx的三個(gè)突變體都不表現(xiàn)明顯的催化活性。當(dāng)突變型與野生

4、型AnTrx等量混合后，發(fā)現(xiàn)突變型AnTrx-C34S可顯著提高野生型AnTrx的催化效率，而突變型AnTrx-C37S卻無此作用。由此證明，AnTrx活性結(jié)構(gòu)域的第37位Cys殘基上的巰基能參與攻擊硫氧還原蛋白和底物蛋白所形成的二硫鍵而釋放被還原的底物蛋白，而第34位Cys殘基同其它微生物的同一活性域一樣參于硫氧化還蛋白與底物的結(jié)合。這一結(jié)果有助于認(rèn)識(shí)真菌硫氧還蛋白第37位活性位點(diǎn)的作用。
　　 AnTrxR的克隆表達(dá)和活性測(cè)

5、定根據(jù)已公布的黑曲霉基因，首次克隆并鑒定了黑曲霉硫氧還蛋白還原酶AnTrx的基因并將其轉(zhuǎn)入E.coli中表達(dá)并獲得純化產(chǎn)物。在NADPH的存在下，AnTrxR除了可以還原Trx之外，還可將二硫代硝基苯甲酸(DTNB)還原成2-硝基，5-硫代苯甲酸(TNB)的形式。利用分光光度計(jì)測(cè)定其在412 nm的吸收值，獲得AnTrxR還原DTNB的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax(±SE)分別為1.8(±0.22)mM和114.6(±8.4)U/mg蛋白

6、，其催化效率(Kcat/Km)為42.4 mM-1s-1。
　　 AnTrx和AnTrxR的融合、表達(dá)純化及其與親本AnTrx和AnTrxR的酶活特性比較分析及在食品工程中的應(yīng)用采用SOE法將麻風(fēng)分歧桿菌(Mycobacterium leprae)中連接TrxR和Trx的天然連接肽Linker A和人工設(shè)計(jì)的柔性肽(GGGGS)3 Linker B插入AnTrx和AnTrxR之間，并顛倒兩者順序，得到四個(gè)融合酶AnTrxR-Li

7、nker A-AnTrx(RMT)、AnTrxR-Linker B-AnTrx(RGT)、AnTrx-Linker A-AnTrxR(TMR)和AnTrx-LinkerB-AnTrxR(TGR)。將分別在E.coli中表達(dá)的各融合酶與獨(dú)立表達(dá)的AnTrx體系進(jìn)行比較分析，首先用二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)還原法還原AnTrx后測(cè)定各自不依賴AnTrxR的酶活，再測(cè)定各自還原特異性底物NADPH、DTNB、AnTrx

8、和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的酶活(一分子的氧化型谷胱甘肽(GSSG)被還原成兩分子的還原型谷胱甘肽(GSH))。最后利用毓基特異熒光分子探針(mBBr)結(jié)合巰基后的熒光顯色，分析其還原食品蛋白中二硫鍵的能力。結(jié)果顯示，在DTT對(duì)AnTrx的還原反應(yīng)中，融合蛋白中AnTrx部分的活性均低于單獨(dú)表達(dá)的AnTrx活性，依次排序?yàn)锳nTrx>TGR>TMR>RGT>RMT。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AnTrxR在N端融合時(shí)，AnTrxR的催化效率明顯

9、高于其在C端融合的催化效率。除TMR和TGR之外，RMT和RGT中的AnTrxR還原DTNB和NADPH的催化效率(Kcat/Km)比親本的AnTrxR要高。在DTNB的還原反應(yīng)中，RMT和RGT的催化效率分別是親本的AnTrxR的65.8和33.5倍。在NADPH的還原反應(yīng)中，二者分別是親本的AnTrxR的3.7和1.4倍。但是，在上述反應(yīng)中，RMT和RGT中AnTrx部分的催化效率均低于親本的AnTrx，在GSSG的的還原反應(yīng)中，二

10、者的催化效率分別是單獨(dú)表達(dá)的AnTrx的46％和68％。在依賴于DTT還原牛胰島素的反應(yīng)中，二者的催化效率分別為親本的AnTrx的31.8％和7.5％。與麥醇溶蛋白共孵育3h后，親本蛋白(AnTrx、AnTrxR)和融合蛋白在還原麥醇溶蛋白二硫鍵的催化效率上未見有顯著差異。各自結(jié)合mBBr熒光條帶的亮度也未見明顯區(qū)別。
　　 以上結(jié)果表明，AnTrx、AnTrxR及其融合蛋白都具有Trx體系的活性。單獨(dú)表達(dá)的AnTrx體系和融合