光學分子影像技術在肝癌動物模型構建及診療中的應用研究.pdf

1、本文從以下幾部分進行論述：
　　一、光學分子影像技術輔助下肝癌動物模型的建立
　　目的:
　　1.借助光學分子影像技術構建裸鼠皮下和原位移植性肝癌動物模型。
　　2.為后續(xù)肝癌藥物療效評估和診療搭建前期動物模型平臺。
　　方法:
　　1.HepG2-fLuc和HepG2-GFP標記的肝癌細胞裸鼠皮下肝癌模型的建立取20只4-6周雄性BALB/c裸鼠，分別抽取含1.0×107/mlHepG2-fLuc和

2、HepG2-GFP細胞懸液接種于裸鼠腋部皮下，HepG2-fLuc細胞接種于左腋下，HepG2-GFP細胞接種于右腋下，各10只，建立裸鼠皮下移植性肝癌模型。
　　2.HepG2-fLuc標記的肝癌細胞裸鼠原位肝癌模型的建立
　　無菌條件下麻醉裸鼠，經右側肋緣下1cm斜切口開腹顯露肝臟，沿肝臟被膜下進針，緩慢推入含1.0×107/ml HepG2-fLuc細胞懸液，逐層關腹，同樣方法建立10只原位模型。
　　3.以上兩

3、種裸鼠肝癌模型在腫瘤細胞接種完成后，借助IVIS200分子影像系統每日觀察裸鼠的出瘤及遠處轉移情況并測量熒光強度、進行三維重建測量腫瘤體積等、繪制體積/熒光/時間增長曲線、統計成瘤率、記錄荷瘤裸鼠生存時間。荷瘤裸鼠死亡后，剝離瘤塊進行病理學檢查。
　　結果:
　　1.二維定量分析結果：
　　使用工具欄中的感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)定量分析工具條對熒光信號進行圈選定量，定量數據出現在ROI

4、上方，信號的強弱以圖中的假色條表示，藍色表示信號弱，紅色表示信號強，假色條上均有數值標尺，下方顯示定量單位及數值上下限。
　　2.三維重建結果：
　　三維可視化模型分別從冠狀面、矢狀面和水平面再現了裸鼠各臟器結構，且可以任意角度旋轉放大透明化，并可以顯示腫瘤位置和定量測量腫瘤體積，便于觀察。
　　3.全部裸鼠瘤細胞接種后均未出現感染等并發(fā)癥。
　　4.生物熒光成像(BLI)和自發(fā)熒光成像(FMI)增長情況。

5、>　　5.腫瘤體積、生物熒光強度值和激發(fā)熒光強度值相關性分析
　　結論:
　　1.裸鼠皮下和原位移植性肝癌模型具有操作簡便、成瘤率高、腫瘤生長周期短、易于控制等優(yōu)點，是研究肝癌生物學行為和篩選抗癌藥物及診療方式的理想模型。
　　2.腫瘤生物熒光強度和激發(fā)熒光強度和腫瘤體積均呈現高度相關性，可反映腫瘤內活細胞數量。
　　3.光學分子影像技術可以實現無創(chuàng)、實時、動態(tài)、連續(xù)、直觀地觀測裸鼠活體內肝癌腫瘤的生物學行為。<

6、br>　　二、光學分子影像技術輔助下芹黃素對肝癌抑制作用的研究
　　目的:
　　1.光學分子影像技術輔助下研究芹黃素對肝癌的抑制作用，以期為發(fā)現新的肝癌治療藥物提供有益的參考。
　　2.探索驗證光學分子影像技術在觀察藥物抗肝癌療效中的應用價值。
　　方法:
　　1.肝癌皮下腫瘤抑制實驗
　　將20只Balb/c裸鼠隨機分為2組:對照組（生理鹽水組）和實驗組（芹黃素組），每組各10只，按照本論文第一部分

7、介紹方法分別用HepG2-fLuc和HepG2-GFP標記的肝癌細胞懸液接種到裸鼠上肢左腋窩和右腋窩處建立肝癌皮下腫瘤模型。
　　2.肝癌原位腫瘤抑制實驗
　　將20只Balb/c裸鼠隨機分為2組:對照組（生理鹽水組）和實驗組（芹黃素組），每組各10只，按照本論文第一部分介紹方法分別用HepG2-fLuc標記的肝癌細胞懸液接種到肝臟包膜下建立肝癌原位腫瘤模型。
　　3.給藥方法
　　待皮下和原位肝癌移植模型成功建

8、立后開始根據各實驗分組情況給予相應的不同藥物處理:(1)對照組:每3天腹腔注射等容量的無菌生理鹽水，共7次;(2)實驗組:芹黃素50mg/kg，腹腔注射，每3天注射1次，共7次。
　　4.各組比較和檢測指標
　　每天觀察裸鼠的體重、精神狀態(tài)、飲食情況、活動規(guī)律及排便等一般情況觀察。IVIS200分子影像系統測量腫瘤熒光強度變化，三維重建測量腫瘤體積變化，并繪制比較各組肝癌移植瘤體積和熒光強度增長曲線。
　　5.動物處置

9、與標本獲取
　　待全荷瘤鼠死亡后，剝離瘤體，觀察大體形態(tài)并稱取瘤重，將各個瘤組織分成兩部分，一部分固定包埋后做病理檢查，余下的瘤組織放-80℃凍存。
　　6.統計學處理
　　連續(xù)變量采用均數±標準差（mean±SD）表示，組間整體比較采用重復測量資料的方差分析，單獨時間點比較采用獨立樣本t檢驗。用Kaplan-Meier法繪制荷瘤裸鼠生存時間并用log rank檢驗比較。數據分析采用IBM SPSS19.0軟件分析，P

10、＜0.05認為差異有統計學意義，Prism5.0軟件繪制圖表。
　　結果:
　　1.裸鼠一般情況
　　20只皮下腫瘤裸鼠接種肝癌細胞10天左右，出現粟粒大小的類圓形結節(jié)，高出皮膚表面，質韌，可活動，以后結節(jié)逐漸增大，移植成功率為100％。
　　2.芹黃素抗肝癌腫瘤作用
　　待肝癌移植模型成功建立后按分組情況開始給藥，治療開始后每天測量移植瘤體積及相應熒光強度值，并繪制移植瘤體積和熒光強度增長曲線。
　

11、　結論:
　　1.芹黃素對肝癌具有明顯的抑制作用，為肝癌的綜合治療提供了新方案。
　　2.光學分子影像技術能直接快速的測量肝癌腫瘤模型中腫瘤的生長、轉移以及對藥物的反應，在對藥物的篩選和評價中具有重要應用價值。
　　三、光學分子影像技術在確定肝臟腫瘤位置及邊界中的應用研究
　　目的:
　　借助光學分子影像手術導航系統進行前期動物實驗及初步臨床驗證，以期利用該方法達到在術中快速、準確、客觀的定位肝臟腫瘤及轉移

12、病灶組織的邊界及判斷腫瘤切除后斷面有無殘留病灶，達到精準、完整切除腫瘤的目的。
　?。ㄒ唬┣捌趧游飳嶒?br>　　方法:
　　1.主要實驗試劑注射用吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)。
　　2.主要實驗儀器
　　IVIS200非侵入式定量分子影像系統
　　光學分子影像手術導航系統（Surgical navigation system，SNS）
　　3.實驗對象和分組
　　將3

13、0只Balb/c裸鼠分別用HepG2-fLuc標記的細胞接種到上肢左腋窩后隨機分為2組:對照組（常規(guī)手術組）和實驗組（SNS引導手術組），每組各15只。
　　4.統計學分析
　　連續(xù)變量采用均數±標準差(mean±SD)表示，對于計數資料，組間比較采用x2檢驗或Fisher's精確檢驗統計分析。用Kaplan-Meier法繪制荷瘤鼠術后生存曲線并用log rank檢驗比較兩組生存時間。數據分析采用IBM SPSS19.0軟件

14、分析，P＜0.05認為差異有統計學意義，Prism5.0軟件繪制圖表。
　　結果:
　　SNS手術導航組在腫瘤殘余率(6.7％ vs.46.7％，p=0.035)方面顯著少于常規(guī)手術組，常規(guī)手術組裸鼠的生存天數最小值為19天，最大值為48天，生存均值為36天，生存中位數為38天，手術導航組裸鼠的生存天數最小值為43天，最大值為68天，生存均值為54天，生存中位數為54天，生存時間明顯長于常規(guī)肉眼手術切除方法的裸鼠，兩組比較差

15、異有統計學意義(p=0.000)，這也說明這種精確治療可以有效的提高生存率，改善預后效果。
　?。ǘ┏醪脚R床驗證
　　方法:
　　1.研究對象
　　選擇對象為在南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院肝膽一科住院待手術病人。
　　2.倫理學要求
　　遵循赫爾辛基宣言和中國有關臨床試驗研究規(guī)范、法規(guī)進行。在試驗開始之前，已通過本實驗研究單位南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院倫理委員會批準認定。
　　3.實驗方法
　　本研究

16、采光學分子影像手術導航系統引導下的ICG對肝臟腫瘤患者進行腫瘤切除手術，將切除的病灶行病理檢查，探討其在肝臟腫瘤邊界界定及發(fā)現殘余病灶中的臨床應用價值。
　　結果:
　　自2014年12月到2015年3月，共5例病人在我院實施了在光學分子影像手術導航系統引導下的肝臟腫瘤切除術，其中3例為肝細胞癌，1例為轉移性肝癌，1例為局灶增生性結節(jié)。所有受試者在提供書面知情同意后，醫(yī)生對實驗流程進行充分解釋。所有患者術前均行腹部超聲和增強