miR-223-5p對肝癌細胞株BEL-7402紫杉醇耐藥性的影響.pdf

1、目的：原發(fā)性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其中約90％為肝細胞性肝癌，發(fā)病率占世界總數(shù)的43.7%，死亡率居我國惡性腫瘤死亡率第2位[1]。手術(shù)切除雖是目前肝癌首選的治療方法，但術(shù)后效果差，復(fù)發(fā)率高，而且大多數(shù)肝癌發(fā)現(xiàn)時已為晚期，不能進行手術(shù)。因此，化療在防止肝癌術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、治療晚期肝癌患者、延長患者生存時間和改善生活質(zhì)量方面具有重要意義。但是，肝癌細胞的強耐藥性嚴重影響著化療效果。大量臨床資料統(tǒng)計顯示，每年導(dǎo)致腫瘤患者死亡的原

2、因中90%以上與腫瘤的化療耐藥密切相關(guān)[2]。因此，深入研究肝癌細胞耐藥發(fā)生的分子機制可以為明確肝癌耐藥發(fā)生機制及尋找肝癌新的治療靶點提供理論依據(jù)。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn) miRNAs在腫瘤的耐藥過程中發(fā)揮著重要作用， miR-223-5p是血液系統(tǒng)惡性腫瘤研究中研究的較為全面的一種 miRNAs分子，其通過對靶基因的調(diào)節(jié)實現(xiàn)調(diào)控細胞增殖、凋亡及分化的目的，最終參與了血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。目前的研究也同樣發(fā)現(xiàn)miR-223-5p在

3、多種實體性腫瘤組織如肝癌、肺癌、胃癌等癌組織中表達量與正常組織相比是有變化的，可見miR-223-5p作為miRNAs家族的重要成員參與了多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，但 miR-223-5p對肝癌耐藥過程的影響至今未見報道。
　　因此本研究旨在探討：紫杉醇對人肝癌細胞株BEL-7402及其耐藥細胞株細胞增殖率的影響以及觀察人肝癌細胞株BEL-7402及其耐藥細胞株中miR-223-5p表達量的差異，從而揭示miR-223-5p在肝癌耐藥

4、過程中所發(fā)揮的作用，最終為解決肝癌細胞化療耐藥提供理論依據(jù)。
　　本研究旨在通過紫杉醇耐藥細胞株的建立，檢測分析miR-223-5p表達與耐藥細胞株耐藥性之間的效應(yīng)關(guān)系，為解決肝癌細胞化療耐藥提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、常規(guī)培養(yǎng)肝癌細胞株（BEL-7402），并建立其對紫杉醇的耐藥細胞株（BEL-7402/Taxol）；
　　2、采用MTT實驗方法，觀察紫杉醇對人肝癌細胞BEL-7402及其耐藥細胞株增殖

5、的抑制作用；
　　3、采用 qRT-PCR技術(shù)，觀察人肝癌細胞 BEL-7402及耐藥細胞株中miR-223-5p的表達量變化。
　　4、將miR-223-5p的抑制劑miR-223-5p inhibitor轉(zhuǎn)染入BEL-7402/Taxol細胞，采用qRT-PCR技術(shù)檢測miR-223-5p的表達量是否改變，同時用MTT檢測紫杉醇對細胞的抑制作用是否有變化。
　　結(jié)果：
　　1、紫杉醇耐藥細胞株的建立及鑒定

6、r>　　通過持續(xù)刺激培養(yǎng)的方式，可以構(gòu)建在含有24ug/mL的紫杉醇培養(yǎng)液中穩(wěn)定傳代的耐藥細胞株BEL-7402/Taxol。無論是親本細胞株還是耐藥細胞株其細胞抑制率都是隨著紫杉醇濃度的升高以及培養(yǎng)時間的延長而升高（P trend<0.05）：即在相同的培養(yǎng)時間下，細胞抑制率隨著紫杉醇濃度的升高而升高，在相同濃度的紫杉醇刺激下，細胞抑制率隨著刺激時間的延長而升高。但是耐藥細胞株在低濃度紫杉醇刺激下，其細胞抑制率隨著培養(yǎng)時間的延長變化不

7、大。
　　2、 BEL-7402/Taxol耐藥細胞株對紫杉醇的耐藥性增加
　　紫杉醇作用24h時，其對BEL-7402及BEL-7402/Taxol細胞的IC50分別為42.81 ug/ml、363.50 ug/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；紫杉醇刺激48h條件下，其對BEL-7402及BEL-7402/Taxol細胞的IC50分別為24.08 ug/ml、160.90ug/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）

8、；紫杉醇刺激72h條件下，其對BEL-7402及BEL-7402/Taxol細胞的IC50分別為18.14 ug/ml、100.14ug/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。耐藥細胞株的IC50值遠高于親本細胞株。
　　3、 BEL-7402/Taxol耐藥細胞株中miR-223-5p的表達升高
　　3.1、紫杉醇在BEL-7402及BEL-7402/Taxol細胞中miR-223-5p表達量的比較：針對穩(wěn)定的肝癌耐藥細

9、胞株 BEL-7402/ Taxol及其親本細胞BEL-7402，分別進行miR-223-5p含量檢測，結(jié)果顯示與親本細胞相比， miR-223-5p在耐藥細胞株中表達增高5.70±0.33倍。
　　3.2、 BEL-7402/ Taxol耐藥細胞株在轉(zhuǎn)染miR-223-5p抑制劑后，可抑制miR-223-5p的表達
　　BEL-7402/ Taxol細胞轉(zhuǎn)染24小時、48小時及72小時后，抑制組（轉(zhuǎn)染miR-223-5p

10、inhibitor） miR-223-5p含量均低于對照組(未轉(zhuǎn)染miR-223-5p inhibitor)，分別為對照組miR-223-5p的(86.3±6.45)%，(77.5±5.89)%及(53.5±4.57)%。
　　4、抑制miR-223-5p表達后可減弱耐藥細胞株的耐藥效應(yīng)
　　終濃度為50ug/ml的紫杉醇作用48h后，對照組細胞抑制率為（13.79±3.32）%，抑制組細胞抑制率為（28.32±4.86）%

11、，抑制組細胞抑制率高于對照組（P<0.05）；終濃度為100ug/ml的紫杉醇作用48h后，對照組細胞抑制率為（39.73±2.62）%，抑制組細胞抑制率為（60.41±8.42）%，抑制組細胞抑制率高于對照組（P<0.05）；終濃度為200ug/ml的紫杉醇作用48h后，對照組細胞抑制率為（55.56±7.63）%，抑制組細胞抑制率為（78.62±6.12）%，抑制組細胞抑制率高于對照組（P<0.05）。無論紫杉醇的終濃度是50ug/

12、ml、100ug/ml還是200ug/ml，抑制組細胞的抑制率均高于對照組，說明抑制miR-223-5p之后BEL-7402/Taxol細胞對紫杉醇的敏感性提高。
　　結(jié)論：
　　1、紫衫醇對于肝癌細胞具有一定的殺傷作用；
　　2、紫杉醇長期刺激會導(dǎo)致肝癌細胞產(chǎn)生一定的耐藥性；
　　3、 miR-223-5p在肝癌細胞耐藥細胞株中的高表達提示其參與了肝癌對紫杉醇產(chǎn)生耐藥性這一過程；
　　4、降低miR-22