家族性高血鉀型高血壓Cullin 3致病突變體neddylation異常的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　Cullin3（CUL3）致病突變體Cullin3Δ9（缺失9號外顯子，CUL3Δ9）可導(dǎo)致家族性高血鉀型高血壓（Familial hyperkalemic hypertension，F(xiàn)HHt）。最新研究發(fā)現(xiàn)CUL3Δ9類泛素化修飾（neddylation）程度較野生型CUL3明顯增強(qiáng)，會導(dǎo)致其連接蛋白KLHL3被過度降解，使得底物WNK激酶累積。本研究將探討CUL3致病突變體CUL3Δ9是否由于與COP9信號體（CO

2、P9 signalosome，CSN）結(jié)合減弱而導(dǎo)致neddylation異常。
　　方法：
　　用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293細(xì)胞株，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將構(gòu)建好的FLAG-CUL3質(zhì)粒和CUL3致病突變體FLAG-CUL3Δ9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，以FLAG抗體與Dynabeads Protein G磁珠行免疫共沉淀技術(shù)，Western blotting觀察CUL3或CUL3Δ9與CSN5的結(jié)

3、合情況；在分別轉(zhuǎn)染上述兩種質(zhì)粒后，用金屬蛋白酶抑制劑1,10-菲咯啉（1,10-phenanthroline）處理轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，或者利用RNAi技術(shù)敲低CSN5，Western blotting觀察CUL3和CUL3Δ9的neddylation的變化。
　　結(jié)果：
　　免疫共沉淀結(jié)果顯示CUL3與CSN5有結(jié)合，而CUL3Δ9與CSN5結(jié)合減弱；以金屬蛋白酶抑制劑1,10-菲羅啉抑制CSN5后，CUL3的neddylation