家族性高膽固醇血癥LDLR新突變體的構建及其功能研究.pdf

1、家族性高膽固醇血癥(FH)是一種常染色體單基因顯性遺傳性疾病,FH的主要臨床表現(xiàn)為血漿總膽固醇(TC),特別是低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)顯著升高,皮膚肌腱黃色瘤及早發(fā)冠心病等。LDLR基因突變是引起FH最常見的原因,臨床確診的FH患者中約一半以上為LDLR基因突變。本課題組共收集30多個FH家系,已發(fā)現(xiàn)20種LDLR基因點突變,包括16種點突變、2種剪接突變和2種缺失突變,但這些突變是否具有致病性,其致病機制如何均不清楚。為了明確

2、高脂血癥的原因,深入了解FH的分子學機制和發(fā)病機理,本實驗在突變分析的基礎上,選用6種突變進行突變體構建和功能研究。
　　[目的]
　　以6例臨床確診的FH患者為研究對象,對各患者進行LDLR基因突變分析,構建野生型和突變體LDLRcDNA真核表達載體,將構建的各表達質粒轉染HEK-293細胞,通過各突變體與野生型比較,重點觀察各突變對LDLR表達和功能的影響,初步探討突變對LDL代謝的作用及突變致FH的分子機制,并為突變患

3、者采取早期治療,防治心血管疾病及產(chǎn)前診斷和家族性研究等提供理論基礎。
　　[方法]
　　取6例臨床確診FH患者EDTA-Na2抗凝血各0.5ml,用酚-氯仿法提取基因組DNA,以基因組DNA為模板,采用PCR結合DNA測序方法排除ApoB基因Q3500R突變;同時以患者基因組DNA為模板,采用降落PCR方法,在同一程序中擴增LDLR基因的啟動子和全部18個外顯子共21個片段,直接進行DNA測序鑒定突變。用Trizol法從正常

4、人肝細胞中提取總RNA并純化,并以純化RNA為模板,反轉錄PCR合成LDLRcDNA全長;將LDLRcDNA全長與PTA2載體連接、轉化大腸桿菌、篩選菌落、提取質粒酶切和測序鑒定,將正確PTA2載體克隆質粒送交廣州復能基因公司負責組裝到真核表達載體pReceiver-M29,構建成含LDLR全長和EGFP綠色熒光蛋白融合表達的載體。以野生型表達載體為模板,用QuickChange XL system誘變試劑盒(Stratagene)構建

5、6種突變體(357delG,675delA, C210R, T383I, A459V, S565X)并經(jīng)測序證實。將野生型及6種突變體質粒轉染HEK-293細胞,同時設一空白對照(未轉染任何基因),轉染48h后提取總蛋白,采用Western檢測LDLR蛋白;另外,將野生型及構建的6種新突變體質粒瞬時轉染HEK-293細胞,48h后分別在4℃和37℃與稀釋在培養(yǎng)基中的DiI-LDL共孵育,流式細胞儀分別檢測LDLR結合、內(nèi)化LDL的能力。

6、
　　[結果]
　　各FH患者均未檢測出ApoB100Q3500R突變,LDLR突變分析發(fā)現(xiàn)6個新突變,包括3個錯義突變(C210R, T383I, A459V)、2個缺失突變(357delG,675delA)和一個無義突變(S565X)。篩選得到正確LDLR及突變體表達載體,測序結果無堿基突變及閱讀框移碼。Western檢測顯示,與野生型比較,C210R, T383I, A459V三種錯義突變蛋白條帶無顯著變化;S565X

7、出現(xiàn)一條截短的蛋白條帶;2個缺失突變(357delG,675delA)出現(xiàn)一條更短的蛋白條帶。與野生型比較,6個LDLR基因新突變體導致細胞結合能力、內(nèi)化能力均明顯降低,分別約為野生型的13％-34%,13%-35%。
　　[結論]
　　1、成功構建6種LDLR新突變體。
　　2、6個LDLR基因新突變均損傷LDLR功能,細胞結合能力明顯降低(13%-34%),內(nèi)化能力也明顯降低(13%-35%),其中LDLR基因突變