大鼠聽覺剝奪后BcL-2、Bax、Fas在聽皮層的表達變化及腦苷肌肽注射液對其變化的影響.pdf

1、目的:通過雙側(cè)耳蝸損毀術建立聽覺剝奪（Auditory Deprivation，AD）動物模型，研究SD大鼠在聽覺剝奪后Bcl-2、Bax、Fas在聽皮層的表達，以及腦苷肌肽注射液對Bcl-2、Bax、Fas表達變化的影響，了解聽覺剝奪后聽覺中樞可塑性變化以及腦苷肌肽注射液的作用，為聽力障礙患者的輔助治療提供動物實驗資料。
　　方法:
　　1、選擇耳廓反射靈敏、無中耳疾患、生后3周齡的雄性清潔級健康SD大鼠，共64只，將其至

2、于適宜的溫、濕度環(huán)境中飼養(yǎng)。按體重將其隨機分為8組（8只/組）:7天對照組，7天手術組，14天對照組，14天手術組，14天治療組，28天對照組，28天手術組，28天治療組。手術組大鼠實施雙側(cè)耳蝸損毀術，對照組大鼠只做耳后切口，治療組大鼠實施雙側(cè)耳蝸損毀術并每日腹腔注射腦苷肌肽注射液，劑量1 ml/kg，連續(xù)14或28天。
　　2、術后7天對各組大鼠進行聽性腦干反應(ABR)測試，然后在相同條件下飼養(yǎng)各組動物至對應的時間點后，每組隨

3、機取4只大鼠的雙側(cè)大腦聽皮層做HE染色和免疫組化檢測，其余4只取聽皮層做實時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡檢測。
　　3、用HE染色的方法觀察大鼠聽皮層部位形態(tài)學變化。
　　4、采用免疫組織化學方法測定大鼠聽皮層部位Bcl-2、Bax、Fas的表達，然后在光鏡下對棕色顆粒陽性細胞數(shù)目進行統(tǒng)計。
　　5、采用RT-PCR技術檢測大鼠聽皮層部位Bcl-2、Bax、Fas基因mRNA的表達。
　　6、采用Western

4、Blot技術檢測大鼠聽皮層部位Bcl-2、Bax、Fas蛋白的表達變化。
　　結果:
　　1、ABR測試情況:對照組SD大鼠經(jīng)ABR測試在40SPL dB時出現(xiàn)重復波形，耳蝸損毀手術大鼠術后7天雙耳在90 SPL dB均不能引出重復波形，證明聽覺剝奪動物模型制作成功。
　　2、術后一般情況:術后第二天聽覺剝奪大鼠即能自主飲水攝食，爬行沿直線，拎尾懸空能保持平衡，但是與對照組相比行動仍顯遲緩。聽覺剝奪大鼠對外界聲音刺激不

5、敏感，耳廓反射消失，而對照組耳廓反應靈敏。
　　3、HE染色結果:手術組和治療組均出現(xiàn)不等量的凋亡細胞，體積縮小，顏色深染，胞漿著色淺淡，核固縮，染色質(zhì)凝集斷裂，核仁消失。治療組與相應的手術組相比，細胞凋亡現(xiàn)象減輕，胞漿紅染程度減輕，細胞核，染色質(zhì)聚集減少。實驗結果表明大鼠在聽覺剝奪后聽皮層出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，腦苷肌肽注射液可以減輕凋亡的程度。
　　4、免疫組化結果:各組各個時間點均有Bcl-2、Bax、Fas陽性細胞。手術組Bc

6、l-2陽性細胞數(shù)明顯低于相應的對照組，治療組Bcl-2陽性細胞數(shù)顯著多于相應的手術組。而手術組Bax和Fas陽性細胞數(shù)顯著高于相應的對照組，治療組陽性細胞數(shù)顯著少于相應的手術組。實驗結果表明聽覺剝奪后大鼠聽皮層表達促凋亡基因Bax和Fas的細胞增多，表達抑凋亡基因Bcl-2的細胞減少，而腦苷肌肽注射液可以阻止這些變化。
　　5、蛋白免疫印跡檢測結果:手術組Bcl-2蛋白灰度比值顯著低于相應的對照組，治療組灰度比值顯著高于相應的手術

7、組。而手術組Bax、Fas蛋白灰度比值顯著高于相應的對照組，治療組灰度比值顯著低于相應的手術組。實驗結果表明聽覺剝奪后大鼠聽皮層促凋亡基因蛋白Bax和Fas表達升高，抑凋亡蛋白Bcl-2表達降低，而腦苷肌肽注射液可以減輕這些變化的程度。
　　6、RT-PCR檢測結果:手術組Bcl-2基因mRNA的表達顯著低于相應的對照組，治療組基因表達比相應的手術組顯著增強。而手術組Bax和Fas基因mRNA的表達顯著高于相應的對照組，治療組基因

8、表達與相應的手術組比較顯著減弱。實驗結果表明聽覺剝奪后大鼠聽皮層促凋亡基因Bax和Fas的表達增強，抑凋亡基因Bcl-2的表達減弱，而腦苷肌肽注射液可以阻止這些變化。
　　結論:
　　1、雙側(cè)耳蝸損毀術能夠建立穩(wěn)定性強的聽覺剝奪動物模型。
　　2、 Bcl-2、Bax、Fas這三個基因在大鼠的聽皮層均有表達。
　　3、Bcl-2、Bax、Fas參與了聽覺剝奪后聽皮層神經(jīng)元凋亡的過程。
　　4、腦苷肌肽注射液