便秘大鼠胃腸道細(xì)胞凋亡及bcl-2，bax變化研究.pdf

1、目的： 采用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)和免疫組化的方法檢測便秘大鼠胃、回腸、橫結(jié)腸粘膜和肌層細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax的表達(dá)，并與正常對照組進(jìn)行對比，以進(jìn)一步了解細(xì)胞凋亡與便秘大鼠胃腸道病變之間的聯(lián)系。 方法： 1、動(dòng)物分組：選取健康Wistar大鼠40只，雌雄各半，按照完全隨機(jī)的方法進(jìn)行分組，實(shí)驗(yàn)組20只，對照組20只，分組后各組間體重、性別無顯著性差異。 2、模型建立：實(shí)驗(yàn)組采用大黃浸

2、液灌胃，首日劑量為800mg/kg(生粉)，此后每日劑量在前一日基礎(chǔ)上增加200mg/kg(生粉)，直至實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)半數(shù)大鼠糞便變稀，保持劑量至80％的稀便消失，繼續(xù)加量給藥，至又有半數(shù)大鼠糞便變稀，如此程序循環(huán)3次，待實(shí)驗(yàn)組第三次80％的稀便消失一周后停止建模，對照組以同等體積蒸餾水灌胃。 3、動(dòng)物處理：切取試驗(yàn)組及對照組大鼠胃竇、回腸、橫結(jié)腸標(biāo)本，進(jìn)行HE染色，采用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)及免疫組化PV法檢測粘膜層和肌層的

3、原位細(xì)胞凋亡及bcl-2、bax在粘膜層和肌層的表達(dá)。 4、統(tǒng)計(jì)分析：本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，選用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。 5、數(shù)據(jù)處理： 5.1、凋亡檢測陽性細(xì)胞細(xì)胞核染成棕黃色，凋亡指數(shù)(AI)的計(jì)算：每例標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(400倍)至少計(jì)算1000個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞所占百分比。 5.2、bcl-2、bax切片結(jié)果以細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃到棕褐

4、顆粒為陽性細(xì)胞。在染色效果好、陽性細(xì)胞分布均勻的區(qū)域，計(jì)數(shù)高倍鏡視野下100個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，以百分?jǐn)?shù)表示。免疫陽性細(xì)胞數(shù)超過10％作為組織陽性診斷標(biāo)準(zhǔn)，再根據(jù)高倍鏡下陽性強(qiáng)度劃分無色為陰性(-).淡黃色為弱陽性(+)、棕黃色為陽性(++)和棕褐色為強(qiáng)陽性(+++)。最后運(yùn)用顯夠圖像分析系(VIDAS)，分別測定胃、回腸、橫結(jié)腸粘膜與肌層免疫反應(yīng)產(chǎn)物的平均光密度值。 結(jié)果： 1 TUNEL標(biāo)記的陽性細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)主要

5、表現(xiàn)為胞核棕黃色著色，胃腸道不同層次均有陽性細(xì)胞分布。實(shí)驗(yàn)組胃粘膜凋亡細(xì)胞明顯多于對照組(p<0.05)；實(shí)驗(yàn)組胃肌層凋亡細(xì)胞多于對照組(p<0.05)；實(shí)驗(yàn)組回腸粘膜凋亡細(xì)胞多于對照組凋亡細(xì)胞(p<0.05)；實(shí)驗(yàn)組回腸肌層凋亡細(xì)胞與對照組相比無顯著差異(p>0.05)；實(shí)驗(yàn)組橫結(jié)腸粘膜凋亡細(xì)胞多于對照組凋亡細(xì)胞(p<0.05)；實(shí)驗(yàn)組橫結(jié)腸肌層凋亡細(xì)胞多于對照組(p<0.05)。 2、免疫組化bcl-2、bax染色：試驗(yàn)組

6、、對照組大鼠胃、回腸與橫結(jié)腸粘膜層、肌層均可見細(xì)胞明顯著色，顯色大多位于胞漿，也有在胞核內(nèi)，為棕黃色，有的表現(xiàn)為小顆粒狀呈彌散性或者片狀分布。試驗(yàn)組大鼠胃粘膜與肌層bcl-2、bax的表達(dá)比較對照組大鼠均明顯增強(qiáng)(p<0.05)，試驗(yàn)組大鼠回腸粘膜bcl-2與bax的表達(dá)比較對照組大鼠明顯增強(qiáng)(p<0.05)，試驗(yàn)組大鼠回腸肌層bcl-2與bax的表達(dá)比較對照組大鼠無顯著意義(p>0.05)，試驗(yàn)組大鼠橫結(jié)腸粘膜bcl-2與bax的表達(dá)

7、比較對照組大鼠均明顯增強(qiáng)(p<0.05)，試驗(yàn)組大鼠橫結(jié)腸肌層bcl-2的表達(dá)比較對照組大鼠均明顯增強(qiáng)(p<0.05)，試驗(yàn)組大鼠橫結(jié)腸肌層bax的表達(dá)比較對照組大鼠無顯著意義(p>0.05)。 3、胃腸道大體病理變化及HE染色：兩組大鼠胃腸道外觀無明顯差別，粘膜無色素沉著。對照組大鼠胃腸道切片HE染色未發(fā)現(xiàn)病變，實(shí)驗(yàn)組大鼠胃腸道切片HE染色可見粘膜慢性炎癥改變，胃腸道全層大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，以固有膜為主，粘膜下肌層部分增厚，

8、膠原纖維化，固有膜水腫，肌層膠原纖維增生，肌間神經(jīng)叢神經(jīng)細(xì)胞空泡變性、減少。 結(jié)論： 1、便秘大鼠胃腸道粘膜層和肌層的凋亡細(xì)胞比較對照組明顯增多，表明便秘大鼠胃腸道病變包括粘膜和肌層。 2、便秘大鼠胃、回腸、橫結(jié)腸粘膜層與肌層凋亡細(xì)胞明顯增多，提示便秘大鼠胃腸道病變不僅局限于結(jié)腸，胃與回腸同樣發(fā)生病變。 3、便秘大鼠胃、橫結(jié)腸肌層凋亡細(xì)胞明顯多于對照組。說明便秘大鼠肌層病變特別是神經(jīng)元的退行性改變和凋亡有