DDFA對重癥胰腺炎大鼠腎臟細胞凋亡及Bax、Bcl-2基因表達的影響.pdf

1、研究背景： 重癥急性胰腺炎(SAP)常并發(fā)多器官功能障礙(MODS)，其胰外器官損傷中腎功能障礙(胰性腎病)發(fā)生率約14％-43％，僅次于肺功能障礙，發(fā)展至急性腎功能衰竭(ARF)后死亡率高達71％-84％。目前對其發(fā)病機制尚不完全清楚，研究表明：與SAP腎臟損傷有關(guān)的因素包括腎臟血流動力學(xué)的異常、炎癥介質(zhì)及細胞因子的作用、腫瘤壞死因子(TNFα)、磷脂酶A2(PLA2)、血小板活化因子(PAF)、內(nèi)皮素(ET)和一氧化氮(NO

2、)、前列環(huán)素(pGI2)和血栓素A2(TXA2)、急性腹腔間隔室綜合癥、細胞凋亡等。其中細胞凋亡及凋亡相關(guān)基因是目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點，在外科多種疾病的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸中已受到越來越多的關(guān)注，在許多疾病繼發(fā)的腎臟損傷的發(fā)病機制中也起著十分重要的作用。動物實驗表明：在糖尿病大鼠、心力衰竭大鼠、阿霉素腎病大鼠及內(nèi)毒素中毒大鼠等的腎臟組織中均發(fā)現(xiàn)細胞凋亡明顯增加，促凋亡基因表達升高，而抑制凋亡的基因表達下降，凋亡細胞數(shù)往往與腎功能惡化程度成正比

3、，表明繼發(fā)性腎臟損傷發(fā)展過程中細胞數(shù)目的減少和腎功能的下降，至少部分是通過細胞凋亡機制引起的，而且細胞凋亡是造成腎功能進一步惡化的重要因素之一。細胞凋亡是受凋亡相關(guān)基因調(diào)控的，一些對繼發(fā)性腎臟損傷有治療作用的藥物正是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達以減少腎臟細胞的凋亡，從而起到保護和改善腎功能的作用。雖然誘發(fā)凋亡的刺激因素各異，但其通過使腎小管上皮細胞丟失而導(dǎo)致腎功能受損，在各種形式的繼發(fā)性腎損傷中均具有重要意義。胰性腎病也是一種繼發(fā)性腎臟損

4、傷，因此可以預(yù)見細胞凋亡及凋亡相關(guān)基因在胰性腎病發(fā)病機制中也起著相當重要的作用，探討SAP腎臟損傷的分子發(fā)病機制，通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因進行及時干預(yù)，以減少腎臟細胞凋亡，應(yīng)當有助于胰性腎病的治療，并將為臨床治療方法上的創(chuàng)新提供理論支持和指明方向，無疑具有重大意義。 DDFA已經(jīng)臨床證實對SAP有明顯的治療效果，但其治療SAP的機理如何，是否通過調(diào)控細胞凋亡對SAP起治療作用，對機體各重要臟器細胞凋亡是否有影響，在什么時間、用什么方

5、式、什么劑量應(yīng)用影響最大、效果最好，DDFA各藥物間在影響細胞凋亡方面是否有協(xié)同或拮抗作用，進一步調(diào)整該方案、調(diào)整藥物間的劑量組合是否有更好的效果，等等，這些問題都需要進行驗證和探索。本課題擬通過動物實驗解決這些問題中的一部分，以利于臨床DDFA方案的進一步完善，并為此方案臨床推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。 目的： 本課題旨在：1、研究正常大鼠腎臟細胞凋亡及Bax、Bcl-2基因的表達情況。2、研究大鼠發(fā)生重癥胰腺炎(SAP)后

6、腎臟細胞凋亡及Bax、Bcl-2基因表達的變化，探討細胞凋亡及Bax、Bcl-2基因表達在SAP大鼠腎臟損傷中的作用，從而明確SAP腎臟損傷的部分機制。3、研究SAP大鼠應(yīng)用DDFA治療后腎臟細胞凋亡及Bax、Bcl-2基因表達的變化情況，明確DDFA對SAP大鼠腎臟損傷的治療作用，探討DDFA對SAP腎臟損傷的治療機制，為DDFA方案的臨床應(yīng)用及推廣提供理論依據(jù)。 材料和方法： 1、45只大鼠隨機分成三組：SO組(假手

7、術(shù)組)15只；SAP組15只；DDFA治療組15只。每組再分為6h、12h、18h三個時間點，每個時間點分配5只大鼠。 2、大鼠SAP模型采用5％牛磺膽酸鈉逆行膽胰管注射法建立；SO組僅行胰膽管穿刺操作，不注射藥物；DDFA組在SAP模型誘發(fā)后，經(jīng)頸靜脈注射DDFA。 3、建模后6h、12h、18h時分別處死各組各時間點大鼠，肉眼觀察腹腔臟器改變情況，HE染色觀察腎臟組織病理變化，全自動生化分析儀測定血Cr、BUN，TU

8、NEL法測定腎臟細胞凋亡，SABC免疫組化染色法測定腎臟Bax、Bcl-2基因表達。 4、采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件建立數(shù)據(jù)庫，均數(shù)比較用完全隨機設(shè)計資料的方差分析，組間兩兩比較用DunnettT3法，細胞凋亡與腎功能損害的相關(guān)性用相關(guān)分析。P＜0.05為差異有顯著性意義。 結(jié)果： 1、SO組腎組織未見病理損害，血Cr、BUN正常，偶見腎臟細胞凋亡，腎小球和腎小管區(qū)Bax均有較弱表達，Bcl-2在腎小管區(qū)有一定

9、的表達。 2、SAP組腎組織病理損害明顯，血Cr、BUN較SO組升高。腎臟細胞凋亡指數(shù)各時間點均顯著高于SO組(均P＜0.01)，腎臟Bax蛋白表達水平各時間點也顯著高于SO組(均P＜0.01)，并且隨病程延長而逐漸增高。SAP組各時間點Bcl-2蛋白的表達水平也高于SO組(差異性分別P＜0.01；P＜0.01；P＜0.05)。Bcl-2/Bax比值則低于SO組，并且隨著時間延長逐漸下降。 3、DDFA組較SAP組腎組織

10、病理損害減輕，血Cr、BUN明顯下降。腎臟各時間點細胞凋亡指數(shù)顯著低于SAP組(差異性分別為P＜0.01；P＜0.01；P＜0.05)，但仍有隨病程延長而逐漸增高的趨勢。腎臟各時間點Bax蛋白表達水平也明顯低于SAP組(差異性分別為P＜0.05；P＜0.05；P＜0.05)。Bcl-2蛋白的表達水平則高于SAP組(差異性分別為P＜0.05；P＜0.05；P＜0.05)。Bcl-2/Bax比值也高于SAP組。 結(jié)論： 1、

11、SAP發(fā)生后，腎臟病理形態(tài)及腎功能均受到明顯損害，凋亡細胞明顯增多，AI升高，并隨著時間延長而逐漸增高，腎小管凋亡現(xiàn)象較。腎小球嚴重，AI的變化與腎功的指標Cr、BUN呈明顯的正相關(guān)。說明SAP腎臟損傷至少部分是通過細胞凋亡機制引起的，而且細胞凋亡尤其是腎小管細胞凋亡是造成腎功能進一步惡化的重要因素之一。 2、應(yīng)用DDFA治療后，腎臟病理形態(tài)改善，腎功能損害減輕，凋亡細胞減少，AI明顯下降，但在一定時間內(nèi)，腎臟損害程度仍有隨時間

12、延長而加重的趨勢。說明DDFA對SAP腎臟損傷有明顯的治療作用，在SAP早期給予DDFA治療對減輕腎臟損害程度、改善預(yù)后是有益的，但單次用藥并不能完全防止SAP腎功損害，應(yīng)考慮繼續(xù)定期追加用藥。 3、正常腎臟腎小球和腎小管區(qū)Bax均有較弱表達，Bcl-2在腎小管區(qū)有一定的表達，總體上兩類基因處于相對平衡狀態(tài)；SAP時Bax和Bcl-2的表達均增強，Bax增強較明顯，并且隨著病程延長而逐漸增高，Bcl-2增幅相對較小，并且12h后