苯妥英鈉對大鼠額葉和小腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax表達(dá)的影響.pdf

1、目的：苯妥英鈉(PTH)系二苯乙內(nèi)酰脲類鈉鹽，是迄今應(yīng)用最廣泛且有效的控制癲癇發(fā)作的藥物之一。但由于其安全血藥濃度范圍窄，血中治療濃度與中毒濃度接近，血藥濃度在常用劑量下個(gè)體差異較大，極易出現(xiàn)毒性反應(yīng)。PTH的不良反應(yīng)涉及多個(gè)系統(tǒng)，主要表現(xiàn)于神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、內(nèi)分泌和淋巴系統(tǒng)反應(yīng)，以及其他的一些毒性反應(yīng)，而其神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)主要表現(xiàn)為小腦前庭功能障礙、錐體外系功能障礙及認(rèn)知功能損害。PTH中毒可因給藥途徑、用藥劑量和用藥療程不同表現(xiàn)為

2、急性中毒和慢性中毒，臨床上急慢性中毒的病例報(bào)道多見。其不良反應(yīng)可能與其影響細(xì)胞凋亡有關(guān)，但癲癇本身亦能引起細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)旨在研究PTH對正常大鼠的影響，按用藥劑量及用藥療程的不同進(jìn)行分組，用DNA原位末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferse-mediated biotinylated deoxyuridine triphosphate nickel end labeling, TUNEL)檢

3、測額葉皮層和小腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡，應(yīng)用免疫組化法檢測額葉皮層和小腦神經(jīng)細(xì)胞Bax和Bcl-2表達(dá)的變化，觀察PTH不良反應(yīng)與神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及Bax和Bcl-2表達(dá)的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1 分組：健康雄性70日齡(Sprague-Dawley,SD)大鼠30只（體重200±20g）。按照隨機(jī)分組原則將其分為3組，分別為A組正常生理鹽水組(n=10)，B組低劑量苯妥英鈉組(n=10)，C組高劑量苯妥英鈉組(n=10)，各

4、組再按療程分為15天組(n=5)和30天組(n=5)。
　　 2 藥物干預(yù)：采用自制灌胃針進(jìn)行灌胃。低劑量組每日總劑量按成人單位體重治療劑量的25倍計(jì)算，PHT約100mg/kg/d，高劑量組按成人單位體重中毒劑量的25倍計(jì)算，PHT約200mg/kg/d，生理鹽水組給予等劑量的生理鹽水，在9:00-11:00Am進(jìn)行灌胃，低劑量、高劑量及生理鹽水分別灌胃15天和30天。
　　 3 動物取材：各組大鼠在深度麻醉下用生理鹽

5、水、4％多聚甲醛溶液經(jīng)左心室、主動脈灌注，取腦組織，將其放置在蠟板上，用刀片在視交叉和乳頭體處垂直橫斷腦組織后，取前段作為額葉(厚約4mm)，再取小腦(厚約4mm)，迅速放入4％多聚甲醛溶液中固定后制作石蠟標(biāo)本。24小時(shí)后進(jìn)行石蠟包埋，常規(guī)切片做細(xì)胞凋亡檢測和免疫組化。
　　 4 神經(jīng)細(xì)胞凋亡的檢測：標(biāo)本做成石蠟切片后，用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸缺口末端標(biāo)記技術(shù)(terminal deoxynucleoti

6、dyl transferse-mediated biotinylated deoxyuridine triphosphate nickel end labeling technique， TUNEL)檢測額葉皮層及小腦凋亡的神經(jīng)細(xì)胞。
　　 5 Bcl-2和Bax陽性細(xì)胞的檢測：標(biāo)本制作方法同上，用免疫組化方法檢測Bcl-2和Bax陽性細(xì)胞即標(biāo)本做成石蠟切片后，經(jīng)抗原修復(fù)、山羊血清封閉后，加Bcl-2和Bax多克隆抗體，在經(jīng)二抗

7、、三抗孵育，DAB顯色后置顯微鏡下觀察陽性結(jié)果。
　　 1 PHT對大鼠額葉皮層和小腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡影響的TUNEL檢測結(jié)果：
　　 額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞低劑量15天組和30天組、高劑量15天組、高劑量30天組和正常對照組偶見凋亡細(xì)胞。
　　 小腦神經(jīng)細(xì)胞正常對照組偶見凋亡細(xì)胞；低劑量15天組和30天組、高劑量15天和30天組凋亡細(xì)胞的數(shù)目增多，不同劑量間和不同療程之間均有顯著差異。
　　 2 PHT對大鼠額葉

8、皮層神經(jīng)細(xì)胞和小腦神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響
　　 2.1 PHT對大鼠額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響
　　 低劑量15天組和30天組皮層神經(jīng)細(xì)胞，高劑量15天組和30天組皮層神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2陽性細(xì)胞較對照組無明顯差異；
　　 低劑量15天組和30天組小腦神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2陽性細(xì)胞較正常對照組減少，陽性細(xì)胞著色和密度均減弱，不同療程兩組之間有顯著差異；
　　 高劑量15天組和30天組小腦神經(jīng)細(xì)胞

9、Bcl-2陽性細(xì)胞較低劑量組減少，有顯著性差異，陽性細(xì)胞著色和密度均減弱，不同療程兩組之間有顯著差異。
　　 3 PHT對大鼠額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞和小腦神經(jīng)細(xì)胞Bax表達(dá)的影響
　　 3.1 PHT對大鼠額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞Bax表達(dá)的影響
　　 低劑量15天組和30天組皮層神經(jīng)細(xì)胞有散在的Bax陽性細(xì)胞：高劑量15天組和30天組皮層神經(jīng)細(xì)胞亦有散在的Bax陽性細(xì)胞，較正常對照組無明顯變化。
　　 3.2 PHT

10、對大鼠小腦神經(jīng)細(xì)胞Bax表達(dá)的影響
　　 低劑量15天組和30天組小腦神經(jīng)細(xì)胞Bax陽性細(xì)胞較正常對照組增多，陽性細(xì)胞著色和密度均增強(qiáng)，不同療程兩組之間有顯著差異；
　　 高劑量15天組和30天組小腦神經(jīng)細(xì)胞Bax陽性細(xì)胞較低劑量組增多，有顯著性差異，陽性細(xì)胞著色和密度均增強(qiáng)，不同療程兩組之間有顯著差異；
　　 結(jié)論：
　　 1 苯妥英鈉在劑量和用藥療程不同的情況下，對成年大鼠額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及Bc