雌激素對(duì)大鼠急性脊髓損傷后BCL-2、BAX基因表達(dá)及細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究雌激素對(duì)急性脊髓損傷后脊髓組織BCL-2、BAX基因表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響。 方法：140只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為：空白組14只，損傷組42只，雌激素藥物組42只和甲基強(qiáng)的松龍藥物組42只，每組包括1h、4h、8h、1d、3d、5d、7d共7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，空白組每點(diǎn)2只SD大鼠，其余組每點(diǎn)各有6只SD大鼠。按改良Allen’s撞擊法致傷力為50gcf(10g×5cm)損傷T9-T10制作動(dòng)物模型，大鼠用10％水合氯醛麻醉，

2、無菌條件下以T9-T10為中心做后正中切口，咬除T9-T10棘突及椎板，空白組只暴露脊髓，不損傷脊髓，給予相同劑量生理鹽水，損傷組術(shù)后30分鐘經(jīng)大鼠尾靜脈給予等量生理鹽水。雌激素藥物組術(shù)后30分鐘經(jīng)大鼠尾靜脈給予苯甲酸雌二醇[100ug/kg]，每天一次，甲基強(qiáng)的松龍藥物組術(shù)后30分鐘經(jīng)大鼠尾靜脈給予靜注大劑量甲基強(qiáng)的松龍(30mg/kg)，在各個(gè)亞組內(nèi)至少有6只動(dòng)物，不足的應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充。分別在各時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，經(jīng)心臟灌注取材，標(biāo)本經(jīng)梯度

3、脫水，浸蠟，石蠟包埋，制成6微米厚切片，通過對(duì)SCI部位標(biāo)本進(jìn)行HE染色觀察鏡下?lián)p傷部位脊髓的病理形態(tài)，同時(shí)對(duì)受損脊髓部位進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡因子BCL-2和BAX基因的表達(dá)及用原位末端標(biāo)記法(TUNEL法)標(biāo)記神經(jīng)元凋亡細(xì)胞，觀察雌激素、甲基強(qiáng)的松龍對(duì)大鼠SCI的神經(jīng)保護(hù)作用。 結(jié)果：(1)BCL-2在空白組各時(shí)間點(diǎn)均未見陽性細(xì)胞表達(dá)，損傷組和各藥物治療組(Table-3)在SCI傷后4h，損傷部位開始出現(xiàn)較明顯的

4、表達(dá)，傷后8h數(shù)量增加，傷后24h達(dá)高峰(BCL-2平均光密度值分別為：損傷組0.273±0.043：雌激素組0.396±0.052；甲強(qiáng)龍組0.395±0.057)，分布范圍擴(kuò)至周圍正常組織，傷后3d開始有減少(BCL-2平均光密度值分別為：損傷組0.207±0.050；雌激素組0.308±0.046；甲強(qiáng)龍組0.301±0.041)，傷后1周基本上只有微弱的陽性表達(dá)。BCL-2陽性細(xì)胞胞質(zhì)著黃色(Fig.10)，神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞均有

5、明顯表達(dá)(Fig.11)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果示雌激素組和甲基強(qiáng)的松龍組BCL-2蛋白表達(dá)(平均光密度值)比損傷組在相同時(shí)間點(diǎn)有明顯差異(P＜0.05)，雌激素組和甲基強(qiáng)的松龍組BCL-2蛋白表達(dá)在相同時(shí)間點(diǎn)無明顯變化，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，各組內(nèi)24h時(shí)間點(diǎn)較其它點(diǎn)BCL-2蛋白表達(dá)均有明顯差異(P＜0.05，Table-3)。(2)BAX在陰性對(duì)照切片上無表達(dá)，空白組有少量陽性表達(dá)，損傷組和各藥物治療組均在脊髓損傷傷后4h，損傷部位

6、的陽性表達(dá)增加(Table-4)，傷后8h損傷部位的陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，24h陽性表達(dá)達(dá)最高峰(BAX平均光密度值分別為：損傷組0.283±0.053；雌激素組0.194±0.047；甲強(qiáng)龍組0.191±0.046)，傷后3d表達(dá)開始減少(BAX平均光密度值分別為：損傷組0.191±0.078；雌激素組0.151±0.051；甲強(qiáng)龍組0.164±0.070)，傷后7d表達(dá)基本趨于傷前水平。BAX陽性細(xì)胞胞質(zhì)著棕黃色(Fig-16)，灰質(zhì)

7、中神經(jīng)元細(xì)胞，白質(zhì)中膠質(zhì)細(xì)胞均有大量陽性細(xì)胞表達(dá)。高倍鏡下可見陽性細(xì)胞部分呈凋亡形態(tài)，陽性信號(hào)主要位于胞漿內(nèi)。圖象分析系統(tǒng)分析結(jié)果顯示雌激素藥物組較損傷組BAX蛋白表達(dá)明顯減少，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果示雌激素組和甲基強(qiáng)的松龍組BAX蛋白表達(dá)比損傷組在同一時(shí)間點(diǎn)有明顯差異(P＜0.05)，雌激素組和甲基強(qiáng)的松龍組BAX蛋白表達(dá)在相同時(shí)間點(diǎn)無明顯變化，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，各組內(nèi)24h時(shí)間點(diǎn)較其它點(diǎn)BAX蛋白表達(dá)均有明顯差異(P＜0.05，T

8、able-4)。(3)空白組零星可見TUNEL陽性細(xì)胞，損傷組及藥物治療組均可見大量TUNEL陽性細(xì)胞，灰質(zhì)、白質(zhì)內(nèi)均可見，脊髓損傷后4h時(shí)陽性細(xì)胞較為稀疏，8h，1d和3d時(shí)陽性細(xì)胞較為稠密，圖象分析系統(tǒng)分析結(jié)果顯示，凋亡細(xì)胞的數(shù)量在各時(shí)間點(diǎn)有明顯差異(P＜0.05，Table-5)，8h時(shí)達(dá)高峰(損傷組31.5±5.0；雌激素組26.8±4.6；甲強(qiáng)龍組27.4±4.7單位：個(gè)/mm2)，以后稍有下降，3d后即開始迅速下降(損傷組2

9、5.2±4.2；雌激素組20.3±5.8；甲強(qiáng)龍組20.9±3.1單位：個(gè)/mm2)，7d時(shí)仍有少量凋亡細(xì)胞。圖象分析系統(tǒng)分析結(jié)果顯示雌激素藥物組較損傷組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯降低，相關(guān)分析結(jié)果豆示有明顯差異(P＜0.05)，雌激素組和甲基強(qiáng)的松龍組細(xì)胞凋亡數(shù)無明顯變化，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(4)BCL-2/BAX值在各時(shí)間點(diǎn)同樣有明顯差異(P＜0.05，Table-6)，傷后8h和1d時(shí)較小，以后逐漸增大，5d和7d時(shí)趨于穩(wěn)定。各數(shù)

10、值結(jié)果顯示BCL-2/BAX值在8h小時(shí)最小(損傷組0.954±0.1 72；雌激素組1.720±0.354；甲強(qiáng)龍組1.715±0.328)，此時(shí)凋亡的細(xì)胞數(shù)最多(損傷組31.5±5.0；雌激素組26.8±4.6；甲強(qiáng)龍組27.4±4.7單位：個(gè)/mm2)，以后隨著BCL-2/BAX值逐漸增大，細(xì)胞凋亡的數(shù)也逐漸下降(Table-7)，對(duì)于損傷組各時(shí)間點(diǎn)相關(guān)分析結(jié)果顯示，BCL-2/BAX值與細(xì)胞凋亡數(shù)呈負(fù)相關(guān)(R=-0.79,P＜0