內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)、微血管密度及子宮內(nèi)膜血流評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性的價(jià)值.pdf

1、目的：隨著輔助生殖技術(shù)（Assisted Reproductive Technology，ART）日新月異的進(jìn)展，試管嬰兒的成功率由20％~30%增加至50%左右。能夠使胚胎成功著床，起到重要作用的是子宮內(nèi)膜的容受性和胚胎質(zhì)量。在均j移植優(yōu)質(zhì)胚胎的基礎(chǔ)上，建立良好的內(nèi)膜容受性是該生理過(guò)程的重要環(huán)節(jié)。子宮內(nèi)膜容受性與調(diào)節(jié)內(nèi)膜血管的因子存在極密切的關(guān)系，與內(nèi)膜的血液供應(yīng)息息相關(guān)。促血管生成相關(guān)因子能夠通過(guò)調(diào)節(jié)血管功能等方面，改善血液供應(yīng)。在

2、許多與血管生成相關(guān)的因子中，我們選擇內(nèi)皮型一氧化氮合酶（ endothelial Nitric Oxide Synthase eNOS）進(jìn)行研究。
　　eNOS作為一種將 L精氨酸和氧氣催化成一氧化氮(Nitric Oxide，NO)的生物蛋白酶，對(duì)調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜局部血供方面起著重要的作用[1]。它催化形成的產(chǎn)物-NO，是一種重要的多功能因子,能夠調(diào)節(jié)血管阻力，參與細(xì)胞損傷修復(fù)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，進(jìn)而介導(dǎo)許多生理功能，發(fā)揮生物作用。eNO

3、S在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)可能參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜局部血液供應(yīng)，影響子宮內(nèi)膜容受性。
　　血管生成可以通過(guò)微血管密度（Microvessel Density MVD）這一指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)。微血管的特點(diǎn)是其內(nèi)皮細(xì)胞能夠經(jīng)過(guò) CD34抗體標(biāo)記并被染色，利用這一特性，我們可以觀察微血管的生成情況[2]。當(dāng)組織中微血管被標(biāo)記的越多時(shí)，也預(yù)示著此處新生的毛細(xì)血管數(shù)量越大，代表該處的血液供應(yīng)更豐富。血流的供應(yīng)可以通過(guò)彩色多普勒超聲監(jiān)測(cè)血流參數(shù)如搏動(dòng)指數(shù)（pu

4、lsatility，PI）、阻力指數(shù)（resistance index，RI）及收縮期與舒張期血流速度比值(systolic/diastolic，S/D)來(lái)體現(xiàn)。
　　所以子宮內(nèi)膜著床窗口期 eNOS表達(dá)、微血管密度及子宮內(nèi)膜血流組成一系列評(píng)價(jià)體外受精—胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transferm，IVF-ET)子宮內(nèi)膜容受性的指標(biāo)。
　　方法：納入2014年8月～2015年6月初

5、次在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科接受IVF助孕治療的患者。納入正常月經(jīng)周期，年齡20-35歲，單純?yōu)檩斅压芤蛩匦蠭VF助孕者共計(jì)60例。收集著床窗口期子宮內(nèi)膜，使用免疫組織化學(xué)技術(shù)及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)eNOS、MVD的表達(dá)。
　　1子宮內(nèi)膜采集：收集行控制性卵巢刺激(controlled ovarian stim

6、ulation,COS)前的自然月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜。首先由特定人員監(jiān)測(cè)卵泡，并用半定量試紙測(cè)定尿促黃體生成素。當(dāng)尿 LH≥20 IU/L時(shí)，肌注絨促性素，并記錄內(nèi)膜厚度及形態(tài)，當(dāng)卵泡消失或體積明顯縮小為排卵[3]。排卵后6~7天，使用GE Voluson E8彩色多普勒超聲診斷儀檢測(cè)子宮內(nèi)膜血流灌注、測(cè)定子宮內(nèi)膜形態(tài)及血流參數(shù)RI、PI、S/D值等。由專(zhuān)人操作，連續(xù)測(cè)量3次并計(jì)算平均值。利用一次性?xún)?nèi)膜取樣器采集著床窗口期內(nèi)膜。一部分于-8

7、0℃保存，一部分存放于甲醛固定液中，取內(nèi)膜后均無(wú)陰道異常出血。
　　2控制性卵巢刺激：排卵后6～7天給予注射用醋酸亮丙瑞林緩釋微球(Gonadotrophin-releasing-hormone agonist， GnRH-a，中國(guó)博恩特)1.4mg，14天后達(dá)到降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)，使用重組人促卵泡激素α(Gonal-F, r-FSH,果納芬，默克雪蘭諾)150-225IU啟動(dòng)，利用超聲監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜和卵泡生長(zhǎng)情況，并結(jié)合雌二醇（Estra

8、diol，E2）等性激素的變化判斷，當(dāng)至少有2個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑大于20 mm時(shí)，當(dāng)晚注射艾澤(重組人絨促性素α，默克雪蘭諾)250μg，艾澤注射后36-37h取卵，適時(shí)向培養(yǎng)皿中加入精子，行IVF受精，進(jìn)行胚胎培養(yǎng)，將培養(yǎng)3天的胚胎植入子宮，均移植優(yōu)質(zhì)胚胎2枚，移植后28天 B超見(jiàn)到孕囊即診斷為臨床妊娠。再根據(jù)臨床妊娠與否分為妊娠組與非妊娠組。其中妊娠組（n=30例），未妊娠組（n=30例）。
　　3 RT-PCR：測(cè)定子宮內(nèi)膜中e

9、NOS mRNA的表達(dá)。首先提取總RNA。加入TriQuick總RNA提取試劑，將子宮內(nèi)膜組織放在冰盒上研磨，各取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組等量子宮內(nèi)膜組織，并加入Rezol1 ml，放置于勻漿器內(nèi)充分勻漿，提取總 RNA，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，繼續(xù)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為340bp，同時(shí)以擴(kuò)增內(nèi)參照片段長(zhǎng)度為605bp的GAPDH。PCR循環(huán)條件為：PCR擴(kuò)增條件:95℃10 min1循環(huán),(94℃45 s,54℃30 s,72℃50

10、 s)35個(gè)循環(huán),72℃延伸7 min,4℃保溫。PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠，行電泳后，利用gel-proanalysis3.1圖像分析系統(tǒng)，進(jìn)行圖像分析及照相。利用內(nèi)參值校正IOD值，將校正后的值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　4免疫組化檢測(cè):使用4%甲醛固定子宮內(nèi)膜后進(jìn)行石蠟包埋，制成約4μm厚連續(xù)性組織切片。分別進(jìn)行HE和 SP法免疫組化染色。經(jīng)過(guò)脫蠟、高壓熱抗原修復(fù)、封閉、加入多克隆兔抗人 eNOS(稀釋濃度為1:100)

11、、加入二抗、利用DAB染料進(jìn)行顯色、再利用蘇木素染料重新染色、經(jīng)過(guò)酒精脫水后變透明、再用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片。利用 PBS作為陰性對(duì)照代替一抗。顯微鏡觀察并拍照。MVD判斷標(biāo)準(zhǔn)使用兔抗人 CD34染色，稀釋濃度為1∶100，采用免疫組化SP法，余步驟同前。依據(jù) Weidner判斷標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)數(shù)MVD。
　　5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)均利用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用((-x)±s)表示，組間差異采用 t檢驗(yàn)

12、;等級(jí)資料利用秩和檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng) P＜0.05時(shí)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩變量相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1 IVF妊娠組(n=30)及未妊娠組(n=30)年齡、不育年限、bFSH(基礎(chǔ)促卵泡生成素)、BMI（體重指數(shù)）、Gn天數(shù)，Gn用量、獲卵數(shù)等比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2 IVF妊娠組子宮內(nèi)膜著床窗口期 eNOSmRNA的表達(dá)

13、明顯高于未妊娠組，eNOSmRNA妊娠組的表達(dá)為(0.72±0.21)，對(duì)照組的表達(dá)(0.29±0.12)，兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3 eNOS在妊娠組及未妊娠組腺體上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)。IVF妊娠組(n=30)，“－”表達(dá)1例，“+“表達(dá)5例，“++”表達(dá)12例，“+++”表達(dá)12例。IVF未妊娠組(n=30),“－”表達(dá)12例，“+”表達(dá)14例，“++”表達(dá)2例，“+++”表達(dá)2例，p<0.05,比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

14、。
　　4 MVD計(jì)數(shù)妊娠組計(jì)數(shù)14.53±3.28,未妊娠組12.20±3.83，P<0.05，兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5 eNOS的表達(dá)與MVD的相關(guān)性分析經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，子宮內(nèi)膜eNOS表達(dá)水平與 MVD計(jì)數(shù)水平呈正相關(guān)（r=0.814，P<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　6妊娠組子宮內(nèi)膜血流搏動(dòng)指數(shù)PI、阻力指數(shù)RI、S/D比值均低于非妊娠組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。妊娠組內(nèi)膜血流較未妊娠組豐富。

15、
　　結(jié)論：
　　1妊娠組著床窗口期eNOSmRNA及蛋白的表達(dá)升高，證實(shí)了eNOS有助于提高子宮內(nèi)膜容受性，增加IVF胚胎著床機(jī)會(huì)，為子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)因子之一。
　　2妊娠組MVD計(jì)數(shù)增加，證實(shí)了MVD增加有助于提高子宮內(nèi)膜容受性；
　　3 eNOS組化評(píng)分與MVD計(jì)數(shù)具有正相關(guān)性，推斷eNOS與子宮內(nèi)膜血流的形成密切相關(guān)。
　　4妊娠組子宮內(nèi)膜PI、RI、S/D低于非妊娠組，血液供應(yīng)也較未妊娠組豐富。