晝夜節(jié)律紊亂對大鼠腦損傷病理改變及NGF治療影響的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）發(fā)病率，致死率及致殘率高，給社會帶來極大的負擔。根據 TBI病理生理過程分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷在損傷后立即導致腦組織擠壓變形，腦血流中斷或者改變、神經元和膠質細胞毀損而死亡，這些損傷無法通過臨床措施實施干預，只能加強預防。繼發(fā)性損傷在原發(fā)性損傷后立即開始直至持續(xù)數月，局部神經化學變化引起一系列生化改變，細胞損傷與修復，增殖與凋亡，代

2、謝改變相互作用進而出現細胞生命終結事件。繼發(fā)性腦損傷的病理生理機制復雜，深入理解影響腦損傷的病理因素，對于TBI的病理理解及治療將會帶來新的啟示。
　　研究證實自然界哺乳動物血壓、神經內分泌激素分泌、睡眠覺醒周期、體溫、尿量變化、褪黑素及生長因子、進食等各種生理、生化、代謝過程都遵循著大約24小時的周期性變化，稱為晝夜節(jié)律（circadian rhythms）。晝夜節(jié)律是各種生物對環(huán)境因素循環(huán)變化長期適應和演化的結果，其廣泛存在各

3、種有機生命中，是自然界中重要的生命現象。
　　晝夜節(jié)律基因調控包括神經干細胞在內的多種細胞增殖，參與修復重建、參與細胞周期進程、影響神經遞質釋放及神經可塑性。目前越來越多的流行病學和遺傳學數據顯示晝夜節(jié)律紊亂與多種疾病發(fā)生、發(fā)展及藥物治療效果密切相關，這些疾病包括認知功能障礙、癡呆及帕金森、心血管系統(tǒng)心絞痛、腦血管意外發(fā)生、代謝綜合征及胰島素抵抗、乳腺癌及藥物治療抵抗等。在腦損傷后患者面臨環(huán)境及病理損壞的影響，晝夜節(jié)律紊亂經常發(fā)生

4、。動物實驗及臨床研究表明腦損傷后晝夜節(jié)律基因表達失衡，因此我們推測晝夜節(jié)律調控大腦神經功能，參與病理損傷過程，但是如何參與及潛在的病理機制尚不明確；同時研究發(fā)現晝夜節(jié)律參與細胞周期進程，影響胰島素，糖皮質激素及抗腫瘤藥物的藥物空間分布及藥理效果。在神經保護治療措施中，神經生長因子（nerve growth factor，NGF）能夠促進神經細胞生長、分化，促進損傷細胞修復，NGF發(fā)揮生物學效應必須經過其自身特異性受體介導，迄今主要發(fā)現兩

5、種NGF受體：高親和力受體(TrkA)和低親和力受體(p75)。NGF與高親和力受體TrkA結合，發(fā)揮正性調節(jié)作用，維持神經元生長、發(fā)育、分化，促進損傷神經元修復；與低親和力受體p75結合發(fā)揮負性調節(jié)作用，誘導細胞凋亡。研究發(fā)現TrkA和p75在腦組織中的表達受到晝夜節(jié)律的調控，呈現24h節(jié)律模式。但是在晝夜節(jié)律紊亂環(huán)境下，對NGF治療影響鮮見報道，我們提出假設在腦損傷狀態(tài)下晝夜節(jié)律紊亂影響TrkA、p75受體表達進而影響NGF治療效果

6、。
　　因此本研究將探討晝夜節(jié)律紊亂對大鼠腦損傷病理改變及對NGF治療效果的影響。我們首先建立大鼠腦損傷動物模型，采用燈光持續(xù)照射導致大鼠晝夜節(jié)律紊亂，連續(xù)干擾14天，觀察大鼠行為學、學習記憶能力的變化，觀察對細胞生存及神經再生的影響；在腦損傷晝夜節(jié)律紊亂的基礎上給與NGF治療，檢測NGF受體表達及凋亡信號基因蛋白改變，明確星形膠質細胞及小膠質細胞在晝夜節(jié)律紊亂下對炎癥因子分泌的影響。本研究為通過外界環(huán)境影響腦損傷的預后，為我們臨

7、床治療提供新的思路，同時也對NGF治療效果優(yōu)化有重要啟示。
　　第一部分晝夜節(jié)律紊亂對大鼠腦損傷病理改變的影響
　　目的：
　　觀察晝夜節(jié)律紊亂對腦損傷病理改變及海馬神經再生的影響
　　材料與方法：
　　制備大鼠顱腦損傷模型，采用正常明暗環(huán)境（Light/Dark，LD）和燈光持續(xù)照射(Light/Light，LL)兩種環(huán)境模式（即正常晝夜節(jié)律與晝夜節(jié)律紊亂），連續(xù)干預14天。實驗大鼠隨機分為4組：正常對照

8、組（Sham/LD）、晝夜節(jié)律紊亂對照組（Sham/LL）、腦損傷/正常晝夜節(jié)律組（TBI/LD）、腦損傷/晝夜節(jié)律紊亂組（TBI/LL），造模后采用Brdu50mg/kg連續(xù)注射7天。采用神經功能評分觀察大鼠行為學改變；平衡木平衡實驗及行走實驗檢測大鼠運動及平衡能力；水迷宮檢測大鼠學習記憶能力改變；14天取腦組織標本，計算腦損傷灶體積；Nissl染色觀察損傷區(qū)域周圍皮質及海馬區(qū)神經元生存細胞數量；采用Brdu標記新生存活細胞、Ki-6

9、7標記增殖細胞、DCX標記新生未成熟神經元細胞，免疫組化測定海馬DG區(qū)14天時新生細胞存活數量、細胞增殖情況及新生未成熟神經元數量。
　　結果：
　　1．對比各組大鼠體重、飲水及攝食量發(fā)現，14天時與 Sham/LD組相比，Sham/LL組大鼠體重、攝食量明顯增加（P＜0.05），飲水量無差異（P＞0.05）；TBI/LD組與Sham/LD組相比，體重及神經功能評分降低（P＜0.05）；TBI/LL組與TBI/LD組相比體重

10、、攝食及神經功能評分均降低（P＜0.05）。
　　2．平衡木實驗及水迷宮實驗結果顯示與Sham/LL組相比，TBI/LD組平衡運動能力降低，學習記憶能力受到明顯損害（P＜0.05）；TB/LL組大鼠較TBI/LD組大鼠平衡能力、運動協(xié)調及認知功能進一步下降（P＜0.05）。
　　3．經 Nissl染色計算損傷灶體積結果顯示 TBI/LL組損傷體積明顯大于TBI/LD組(34.33±1.58mm3 VS23.97±2.94mm

11、3，P＜0.05)；同時TBI/LL組腦損傷區(qū)域周圍及海馬CA1區(qū)神經元生存數量減少，但海馬DG區(qū)細胞數量無明顯差異。
　　4．腦損傷后TBI/LD組與Sham/LD組相比，海馬DG區(qū)Ki-67陽性細胞數量增加，同時Brdu標記新生細胞存活數量也增加(P＜0.05)；TBI/LL組海馬DG區(qū)Ki-67陽性細胞數量及Brdu標記新生細胞存活數量較Sham/LD組和TBI/LD組明顯減少(P＜0.05)。
　　5．用DCX陽性細

12、胞標記未成熟神經元，TBI/LD組與Sham/LD組相比，海馬DG區(qū)未成熟神經元數量增加，但TBI/LL組海馬DG區(qū)未成熟神經元細胞數量明顯減少(P＜0.05)。
　　結論：
　　大鼠腦損傷后伴隨晝夜節(jié)律紊亂將使其體重減輕，神經功能損害癥狀加重，平衡運動能力及認知能力受到損害、大鼠腦損傷體積增加，同時腦內神經元生存數量及新生神經元數量減少。
　　第二部分晝夜節(jié)律紊亂對NGF治療影響的機制研究
　　目的：
　

13、　探討晝夜節(jié)律紊亂對NGF治療效果的影響及分子機制
　　材料與方法：
　　制備大鼠顱腦損傷模型，采用正常明暗環(huán)境（Light/Dark，LD）和夜晚燈光持續(xù)照射(Light/Light，LL)兩種環(huán)境模式（即正常晝夜節(jié)律與晝夜節(jié)律紊亂），連續(xù)干預14天。實驗大鼠隨機分為3組：正常對照組（Sham/LD）、腦損傷正常節(jié)律加 NGF治療組（TBI/LD/NGF）、腦損傷晝夜節(jié)律紊亂加 NGF治療組（TBI/LL/NGF）。NGF

14、治療按32ug/kg劑量肌肉注射，連續(xù)注射14天。采用神經功能評分觀察大鼠行為學改變；平衡木平衡實驗及行走實驗檢測大鼠運動及平衡能力；水迷宮檢測大鼠學習記憶能力改變；實時定量PCR大鼠腦組織中NGF受體TrkA和p75（NTR）通路相關基因AKT、NTRAK1、NFKβ、BCL-2、BAX、JNK、Caspase-3 mRNA在轉錄水平的相對表達；Westernblot測定NGF受體信號通路TrkA、p75（NTR）、JNK、Caspa

15、se-3、AKT、NFKβ、NCoR、PARP蛋白含量；免疫熒光觀察TrkA、p75（NTR）受體表達及星形膠質細胞增殖、小膠質細胞活化情況；TUNEL法檢測腦損傷區(qū)域凋亡細胞數量；Elisa法檢測炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-β在血清和腦組織中的含量。
　　結果：
　　1．對各組大鼠神經功能評分及平衡木實驗結果顯示，TBI/LL/NGF組大鼠神經功能損害恢復明顯延遲于TBI/LD/NGF組，損傷后14天時平衡木平衡

16、時間明顯縮短，同時行走時間延長（P＜0.05）。
　　2．水迷宮試驗中，定位巡航階段，TBI/LL/NGF組由于晝夜節(jié)律紊亂，潛伏期延長，學習能力低于 TBI/LD/NGF組（P＜0.05）；在空間探索階段，TBI/LD/NGF組空間探索時間及穿越平臺次數明顯多于 TBI/LL/NGF組（P＜0.05）。
　　3．實時定量PCR顯示TBI/LD/NGF組在晝夜節(jié)律正常情況下NGF高親和力受體TrkA、及細胞生長、分化相關基因

17、AKT、NTRAK1、NFKβ、BCL-2表達增高，低親和力p75及凋亡相關基因BAX、JNK、Caspase-3表達降低；相反在晝夜節(jié)律紊亂條件下TrkA、AKT、NTRAK1、NFKβ、BCL-2表達降低，p75及凋亡相關基因BAX、JNK、Caspase-3表達呈增高趨勢。同時Westernblot結果也與mRNA表達相一致。
　　4．免疫熒光發(fā)現在 TBI/LD/NGF組 TrkA受體陽性細胞明顯多于TBI/LL/NGF組

18、（P＜0.05），但是p75（NTR）陽性細胞少于TBI/LL/NGF組（P＜0.05）。TUNEL染色顯示TBI/LD/NGF組凋亡細胞數量明顯少于TBI/LL/NGF組（P＜0.05）。
　　5．免疫熒光對GFAP陽性星形膠質細胞標記顯示在TBI/LL/NGF組星形膠質細胞反應性增生明顯多于TBI/LD/NGF組（TBI/LL/NGF:466.90±65.10/field VS339.56±48.37/field，P＜0.05

19、）；同時由于晝夜節(jié)律紊亂小膠質細胞活化也呈增多趨勢（TBI/LL/NGF:115.60±23.62/field VS65.40±12.55/field，P＜0.05）。
　　6．在血清及腦組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-β分泌TBI/LL/NGF組也明顯高于TBI/LD/NGF組（P＜0.05）。
　　結論：
　　在晝夜節(jié)律紊亂條件下，NGF對腦損傷治療作用下降。與NGF在正常節(jié)律條件下相比，神經功能障礙及