晝夜節(jié)律紊亂對(duì)大鼠腦損傷病理改變及NGF治療影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）發(fā)病率，致死率及致殘率高，給社會(huì)帶來(lái)極大的負(fù)擔(dān)。根據(jù) TBI病理生理過(guò)程分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷在損傷后立即導(dǎo)致腦組織擠壓變形，腦血流中斷或者改變、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞毀損而死亡，這些損傷無(wú)法通過(guò)臨床措施實(shí)施干預(yù)，只能加強(qiáng)預(yù)防。繼發(fā)性損傷在原發(fā)性損傷后立即開(kāi)始直至持續(xù)數(shù)月，局部神經(jīng)化學(xué)變化引起一系列生化改變，細(xì)胞損傷與修復(fù)，增殖與凋亡，代

2、謝改變相互作用進(jìn)而出現(xiàn)細(xì)胞生命終結(jié)事件。繼發(fā)性腦損傷的病理生理機(jī)制復(fù)雜，深入理解影響腦損傷的病理因素，對(duì)于TBI的病理理解及治療將會(huì)帶來(lái)新的啟示。
　　研究證實(shí)自然界哺乳動(dòng)物血壓、神經(jīng)內(nèi)分泌激素分泌、睡眠覺(jué)醒周期、體溫、尿量變化、褪黑素及生長(zhǎng)因子、進(jìn)食等各種生理、生化、代謝過(guò)程都遵循著大約24小時(shí)的周期性變化，稱為晝夜節(jié)律（circadian rhythms）。晝夜節(jié)律是各種生物對(duì)環(huán)境因素循環(huán)變化長(zhǎng)期適應(yīng)和演化的結(jié)果，其廣泛存在各

3、種有機(jī)生命中，是自然界中重要的生命現(xiàn)象。
　　晝夜節(jié)律基因調(diào)控包括神經(jīng)干細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞增殖，參與修復(fù)重建、參與細(xì)胞周期進(jìn)程、影響神經(jīng)遞質(zhì)釋放及神經(jīng)可塑性。目前越來(lái)越多的流行病學(xué)和遺傳學(xué)數(shù)據(jù)顯示晝夜節(jié)律紊亂與多種疾病發(fā)生、發(fā)展及藥物治療效果密切相關(guān)，這些疾病包括認(rèn)知功能障礙、癡呆及帕金森、心血管系統(tǒng)心絞痛、腦血管意外發(fā)生、代謝綜合征及胰島素抵抗、乳腺癌及藥物治療抵抗等。在腦損傷后患者面臨環(huán)境及病理?yè)p壞的影響，晝夜節(jié)律紊亂經(jīng)常發(fā)生

4、。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明腦損傷后晝夜節(jié)律基因表達(dá)失衡，因此我們推測(cè)晝夜節(jié)律調(diào)控大腦神經(jīng)功能，參與病理?yè)p傷過(guò)程，但是如何參與及潛在的病理機(jī)制尚不明確；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)晝夜節(jié)律參與細(xì)胞周期進(jìn)程，影響胰島素，糖皮質(zhì)激素及抗腫瘤藥物的藥物空間分布及藥理效果。在神經(jīng)保護(hù)治療措施中，神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化，促進(jìn)損傷細(xì)胞修復(fù)，NGF發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)必須經(jīng)過(guò)其自身特異性受體介導(dǎo)，迄今主要發(fā)現(xiàn)兩

5、種NGF受體：高親和力受體(TrkA)和低親和力受體(p75)。NGF與高親和力受體TrkA結(jié)合，發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用，維持神經(jīng)元生長(zhǎng)、發(fā)育、分化，促進(jìn)損傷神經(jīng)元修復(fù)；與低親和力受體p75結(jié)合發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)TrkA和p75在腦組織中的表達(dá)受到晝夜節(jié)律的調(diào)控，呈現(xiàn)24h節(jié)律模式。但是在晝夜節(jié)律紊亂環(huán)境下，對(duì)NGF治療影響鮮見(jiàn)報(bào)道，我們提出假設(shè)在腦損傷狀態(tài)下晝夜節(jié)律紊亂影響TrkA、p75受體表達(dá)進(jìn)而影響NGF治療效果

6、。
　　因此本研究將探討晝夜節(jié)律紊亂對(duì)大鼠腦損傷病理改變及對(duì)NGF治療效果的影響。我們首先建立大鼠腦損傷動(dòng)物模型，采用燈光持續(xù)照射導(dǎo)致大鼠晝夜節(jié)律紊亂，連續(xù)干擾14天，觀察大鼠行為學(xué)、學(xué)習(xí)記憶能力的變化，觀察對(duì)細(xì)胞生存及神經(jīng)再生的影響；在腦損傷晝夜節(jié)律紊亂的基礎(chǔ)上給與NGF治療，檢測(cè)NGF受體表達(dá)及凋亡信號(hào)基因蛋白改變，明確星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞在晝夜節(jié)律紊亂下對(duì)炎癥因子分泌的影響。本研究為通過(guò)外界環(huán)境影響腦損傷的預(yù)后，為我們臨

7、床治療提供新的思路，同時(shí)也對(duì)NGF治療效果優(yōu)化有重要啟示。
　　第一部分晝夜節(jié)律紊亂對(duì)大鼠腦損傷病理改變的影響
　　目的：
　　觀察晝夜節(jié)律紊亂對(duì)腦損傷病理改變及海馬神經(jīng)再生的影響
　　材料與方法：
　　制備大鼠顱腦損傷模型，采用正常明暗環(huán)境（Light/Dark，LD）和燈光持續(xù)照射(Light/Light，LL)兩種環(huán)境模式（即正常晝夜節(jié)律與晝夜節(jié)律紊亂），連續(xù)干預(yù)14天。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照

8、組（Sham/LD）、晝夜節(jié)律紊亂對(duì)照組（Sham/LL）、腦損傷/正常晝夜節(jié)律組（TBI/LD）、腦損傷/晝夜節(jié)律紊亂組（TBI/LL），造模后采用Brdu50mg/kg連續(xù)注射7天。采用神經(jīng)功能評(píng)分觀察大鼠行為學(xué)改變；平衡木平衡實(shí)驗(yàn)及行走實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠運(yùn)動(dòng)及平衡能力；水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力改變；14天取腦組織標(biāo)本，計(jì)算腦損傷灶體積；Nissl染色觀察損傷區(qū)域周圍皮質(zhì)及海馬區(qū)神經(jīng)元生存細(xì)胞數(shù)量；采用Brdu標(biāo)記新生存活細(xì)胞、Ki-6

9、7標(biāo)記增殖細(xì)胞、DCX標(biāo)記新生未成熟神經(jīng)元細(xì)胞，免疫組化測(cè)定海馬DG區(qū)14天時(shí)新生細(xì)胞存活數(shù)量、細(xì)胞增殖情況及新生未成熟神經(jīng)元數(shù)量。
　　結(jié)果：
　　1．對(duì)比各組大鼠體重、飲水及攝食量發(fā)現(xiàn)，14天時(shí)與 Sham/LD組相比，Sham/LL組大鼠體重、攝食量明顯增加（P＜0.05），飲水量無(wú)差異（P＞0.05）；TBI/LD組與Sham/LD組相比，體重及神經(jīng)功能評(píng)分降低（P＜0.05）；TBI/LL組與TBI/LD組相比體重

10、、攝食及神經(jīng)功能評(píng)分均降低（P＜0.05）。
　　2．平衡木實(shí)驗(yàn)及水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與Sham/LL組相比，TBI/LD組平衡運(yùn)動(dòng)能力降低，學(xué)習(xí)記憶能力受到明顯損害（P＜0.05）；TB/LL組大鼠較TBI/LD組大鼠平衡能力、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)及認(rèn)知功能進(jìn)一步下降（P＜0.05）。
　　3．經(jīng) Nissl染色計(jì)算損傷灶體積結(jié)果顯示 TBI/LL組損傷體積明顯大于TBI/LD組(34.33±1.58mm3 VS23.97±2.94mm

11、3，P＜0.05)；同時(shí)TBI/LL組腦損傷區(qū)域周圍及海馬CA1區(qū)神經(jīng)元生存數(shù)量減少，但海馬DG區(qū)細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差異。
　　4．腦損傷后TBI/LD組與Sham/LD組相比，海馬DG區(qū)Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加，同時(shí)Brdu標(biāo)記新生細(xì)胞存活數(shù)量也增加(P＜0.05)；TBI/LL組海馬DG區(qū)Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及Brdu標(biāo)記新生細(xì)胞存活數(shù)量較Sham/LD組和TBI/LD組明顯減少(P＜0.05)。
　　5．用DCX陽(yáng)性細(xì)

12、胞標(biāo)記未成熟神經(jīng)元，TBI/LD組與Sham/LD組相比，海馬DG區(qū)未成熟神經(jīng)元數(shù)量增加，但TBI/LL組海馬DG區(qū)未成熟神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　大鼠腦損傷后伴隨晝夜節(jié)律紊亂將使其體重減輕，神經(jīng)功能損害癥狀加重，平衡運(yùn)動(dòng)能力及認(rèn)知能力受到損害、大鼠腦損傷體積增加，同時(shí)腦內(nèi)神經(jīng)元生存數(shù)量及新生神經(jīng)元數(shù)量減少。
　　第二部分晝夜節(jié)律紊亂對(duì)NGF治療影響的機(jī)制研究
　　目的：
　

13、　探討晝夜節(jié)律紊亂對(duì)NGF治療效果的影響及分子機(jī)制
　　材料與方法：
　　制備大鼠顱腦損傷模型，采用正常明暗環(huán)境（Light/Dark，LD）和夜晚燈光持續(xù)照射(Light/Light，LL)兩種環(huán)境模式（即正常晝夜節(jié)律與晝夜節(jié)律紊亂），連續(xù)干預(yù)14天。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組（Sham/LD）、腦損傷正常節(jié)律加 NGF治療組（TBI/LD/NGF）、腦損傷晝夜節(jié)律紊亂加 NGF治療組（TBI/LL/NGF）。NGF

14、治療按32ug/kg劑量肌肉注射，連續(xù)注射14天。采用神經(jīng)功能評(píng)分觀察大鼠行為學(xué)改變；平衡木平衡實(shí)驗(yàn)及行走實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠運(yùn)動(dòng)及平衡能力；水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力改變；實(shí)時(shí)定量PCR大鼠腦組織中NGF受體TrkA和p75（NTR）通路相關(guān)基因AKT、NTRAK1、NFKβ、BCL-2、BAX、JNK、Caspase-3 mRNA在轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)；Westernblot測(cè)定NGF受體信號(hào)通路TrkA、p75（NTR）、JNK、Caspa

15、se-3、AKT、NFKβ、NCoR、PARP蛋白含量；免疫熒光觀察TrkA、p75（NTR）受體表達(dá)及星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況；TUNEL法檢測(cè)腦損傷區(qū)域凋亡細(xì)胞數(shù)量；Elisa法檢測(cè)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-β在血清和腦組織中的含量。
　　結(jié)果：
　　1．對(duì)各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及平衡木實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TBI/LL/NGF組大鼠神經(jīng)功能損害恢復(fù)明顯延遲于TBI/LD/NGF組，損傷后14天時(shí)平衡木平衡

16、時(shí)間明顯縮短，同時(shí)行走時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.05）。
　　2．水迷宮試驗(yàn)中，定位巡航階段，TBI/LL/NGF組由于晝夜節(jié)律紊亂，潛伏期延長(zhǎng)，學(xué)習(xí)能力低于 TBI/LD/NGF組（P＜0.05）；在空間探索階段，TBI/LD/NGF組空間探索時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)明顯多于 TBI/LL/NGF組（P＜0.05）。
　　3．實(shí)時(shí)定量PCR顯示TBI/LD/NGF組在晝夜節(jié)律正常情況下NGF高親和力受體TrkA、及細(xì)胞生長(zhǎng)、分化相關(guān)基因

17、AKT、NTRAK1、NFKβ、BCL-2表達(dá)增高，低親和力p75及凋亡相關(guān)基因BAX、JNK、Caspase-3表達(dá)降低；相反在晝夜節(jié)律紊亂條件下TrkA、AKT、NTRAK1、NFKβ、BCL-2表達(dá)降低，p75及凋亡相關(guān)基因BAX、JNK、Caspase-3表達(dá)呈增高趨勢(shì)。同時(shí)Westernblot結(jié)果也與mRNA表達(dá)相一致。
　　4．免疫熒光發(fā)現(xiàn)在 TBI/LD/NGF組 TrkA受體陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于TBI/LL/NGF組

18、（P＜0.05），但是p75（NTR）陽(yáng)性細(xì)胞少于TBI/LL/NGF組（P＜0.05）。TUNEL染色顯示TBI/LD/NGF組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯少于TBI/LL/NGF組（P＜0.05）。
　　5．免疫熒光對(duì)GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記顯示在TBI/LL/NGF組星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生明顯多于TBI/LD/NGF組（TBI/LL/NGF:466.90±65.10/field VS339.56±48.37/field，P＜0.05

19、）；同時(shí)由于晝夜節(jié)律紊亂小膠質(zhì)細(xì)胞活化也呈增多趨勢(shì)（TBI/LL/NGF:115.60±23.62/field VS65.40±12.55/field，P＜0.05）。
　　6．在血清及腦組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-β分泌TBI/LL/NGF組也明顯高于TBI/LD/NGF組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　在晝夜節(jié)律紊亂條件下，NGF對(duì)腦損傷治療作用下降。與NGF在正常節(jié)律條件下相比，神經(jīng)功能障礙及