基于胸腺代謝組學和生物種基因的衛(wèi)氣年節(jié)律及衛(wèi)氣虛證的實驗研究.pdf

1、衛(wèi)氣學說源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，是中醫(yī)學基本理論之一。代謝組學技術(shù)提供了這個方面的可能性。代謝組學(metabolomics/metabonomics)是繼基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學之后興起的系統(tǒng)生物學的一個新的分支，是系統(tǒng)研究病理生理刺激后代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，來揭示機體生命活動代謝本質(zhì)的科學，是系統(tǒng)生物學的重要組成部分。它以組群指標分析為基礎(chǔ)，以高通量檢測和數(shù)據(jù)處理為手段，定性定量研究生物體的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，分析生物體在不同狀態(tài)下代謝指

2、紋圖譜的差異，獲得相應(yīng)的生物標志物群，從而揭示生物體在特定時間、環(huán)境下的整體功能狀態(tài)。代謝組學拋開體內(nèi)紛繁復(fù)雜的生化分子互相作用和網(wǎng)絡(luò)式代謝過程變化，對代謝的終端產(chǎn)物進行多元化綜合分析，從整體上展示生物體內(nèi)在的變化狀態(tài)，避免了以往采用單一指標或少數(shù)幾個指標研究某種病理和生理變化的片面性，與中醫(yī)治療疾病和用藥的整體觀念相吻合。
　　我們前期的研究已經(jīng)初步證實衛(wèi)氣的年節(jié)律變化的存在，而節(jié)律變化的內(nèi)在原因尚不清楚，生物鐘基因的研究深入提

3、供了探討該問題的可能。生物鐘基因普遍存在于生物界，其作用在于產(chǎn)生和控制晝夜生物節(jié)律的運轉(zhuǎn)。晝夜節(jié)律變化普遍存在于各種生物體，生物的多種生理、生化、行為過程中都表現(xiàn)出一定的晝夜節(jié)律特征。生物鐘基因的發(fā)現(xiàn)和對其活動規(guī)律的揭示，使對生物晝夜節(jié)律的研究獲得突破性進展。而生物鐘相關(guān)的衛(wèi)氣年節(jié)律研究目前尚無相關(guān)報道。本試驗運用現(xiàn)代時間生物學理論及其研究方法探索衛(wèi)氣的年節(jié)律性變化特征，為衛(wèi)氣相關(guān)疾病的臨床治療提供理論參考和實驗依據(jù)。在哺乳動物中，生物

4、節(jié)律主要包括Clock、Bmall、Per、Cry等在內(nèi)的生物鐘基因及其蛋白產(chǎn)物組成的自身調(diào)控反饋環(huán)路。
　　本課題遵循整體觀念和《內(nèi)經(jīng)》衛(wèi)氣理論的本意，依據(jù)衛(wèi)氣年節(jié)律的周期變化，在前期實驗的基礎(chǔ)上，依據(jù)自然界的年周期規(guī)律，在農(nóng)歷的春分、夏至、秋分和冬至四個時間點對大鼠胸腺進行代謝組學檢測，并對血淋巴細胞進行生物鐘相關(guān)基因表達測定，從而探討衛(wèi)氣年節(jié)律變化的基因節(jié)律調(diào)節(jié)機制，尋找體現(xiàn)衛(wèi)氣年周期變化的小分子物質(zhì)基礎(chǔ)，推測在自然界年周期

5、變化的時相下，生物鐘相關(guān)基因與發(fā)揮防御機制的衛(wèi)氣小分子物質(zhì)的聯(lián)動調(diào)節(jié)機制。通過研究衛(wèi)氣的年周期變化及調(diào)節(jié)機制、探尋衛(wèi)氣的實質(zhì)及物質(zhì)基礎(chǔ)，為中醫(yī)臨床衛(wèi)氣相關(guān)疾病的預(yù)防和診治提供實驗學支持。本文主要從以下幾部分展開論述:
　　第一部分 衛(wèi)氣節(jié)律的相關(guān)理論探討
　　目的:從相關(guān)文獻中發(fā)掘衛(wèi)氣的節(jié)律性變化規(guī)律及相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)
　　方法:查閱和提煉文獻，從衛(wèi)氣的生成來源、循行、功能、本質(zhì)、有關(guān)節(jié)律、衛(wèi)氣理論的臨床應(yīng)用等角度，對衛(wèi)氣

6、進行綜合論述，為衛(wèi)氣的節(jié)律性研究提供理論支持。
　　結(jié)論:目前衛(wèi)氣的現(xiàn)代研究大多忽略了衛(wèi)氣的年、月、日的生理節(jié)律及慓疾滑利的運行特點，對衛(wèi)氣的物質(zhì)本質(zhì)及節(jié)律的形成機制還缺乏整體而全面的認識和研究。
　　第二部分 實驗研究
　　實驗一:基于胸腺代謝組學對正常SD雄性大鼠衛(wèi)氣年節(jié)律變化的研究
　　目的:通過代謝組學的方法對春夏秋冬四季的SD大鼠的胸腺進行物質(zhì)測定，找出四季都包括并且存在變化節(jié)律的物質(zhì)。
　　方法

7、:SD雄性大鼠衛(wèi)氣虛模型組采用疲勞寒熱交替刺激法制備，正常組給予常規(guī)飼養(yǎng)，每日灌服等量等溫純凈水。分別于秋分日（2013年9月23日）、冬至日（2013年12月22日）、春分日（2014年3月21日）、夏至日（2014年6月21日的中午12:00左右，對秋分、冬至、春分、夏至四組大鼠（每組20只）斷頭取血，用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，對胸腺進行代謝物檢測。利用主成分分析法(principal componentanalysis，PCA)和偏

8、最小二乘法(partial least squares，PLS)對檢測的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:春、夏、秋、冬四個季節(jié)中正常組與模型組具有明顯差異的代謝譜變化，本研究在負離子模式下共獲得5個主成分，累積R2X=0.803，如Table1.1所示。我們推測出cAMP（環(huán)磷酸腺苷）、Malic acid(蘋果酸)、Homocarnosine(高肌肽)、Uridine(尿苷)、Cortisol(皮質(zhì)醇)為體現(xiàn)衛(wèi)氣在不同季節(jié)變化規(guī)律

9、的潛在標志物。
　　結(jié)論:推測出cAMP（環(huán)磷酸腺苷）、Malic acid(蘋果酸)、Homocamosine(高肌肽)、Uridine(尿苷)、Cortisol(皮質(zhì)醇)可能為代表衛(wèi)氣在不同季節(jié)變化的潛在標志物。
　　實驗二:基于胸腺代謝組學對衛(wèi)氣虛SD大鼠代謝物變化及玉屏風干預(yù)效果的實驗研究
　　目的:運用代謝組學方法研究衛(wèi)氣虛SD大鼠經(jīng)玉屏風顆粒干預(yù)的胸腺代謝組學特征，對發(fā)現(xiàn)的潛在衛(wèi)氣虛標記物進行反證，以明確其

10、可靠性。
　　方法:SD雄性大鼠衛(wèi)氣虛模型組采用疲勞寒熱交替刺激法制備，治療組給予玉屏分散顆粒溶液灌服，正常組給予常規(guī)飼養(yǎng)，每日灌服等量等溫純凈水。分別于秋分日（2013年9月23日）、冬至日（2013年12月22日）、春分日(2014年3月21日)、夏至日（2014年6月21日）的中午12:00左右，對正常組、模型組和治療組3組大鼠（每組40只）斷頭取血，用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，對胸腺進行代謝物檢測。利用主成分分析法(princ

11、ipal component analysis，PCA)和偏最小二乘法(partialleast squares，PLS)對檢測的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并與正常組比較，反證玉屏散的治療效果。
　　結(jié)果:實驗大鼠在處于衛(wèi)氣虛狀態(tài)時蘋果酸、環(huán)磷酸腺苷、高肌肽、皮質(zhì)醇四種物質(zhì)與正常組相比呈現(xiàn)降低趨勢，尿苷與正常組相比呈現(xiàn)升高趨勢，給予玉屏風顆粒干預(yù)治療后衛(wèi)氣虛狀態(tài)被打破，病理變化出現(xiàn)扭轉(zhuǎn)，前兩種物質(zhì)又開始向正常組水平靠攏，尿苷也開始向正常組

12、水平偏離，因此該實驗反證了蘋果酸、環(huán)磷酸腺苷和尿苷三種是衛(wèi)氣虛證的潛在標志物的可能性，高肌肽和皮質(zhì)醇兩種物質(zhì)在給予玉屏風顆粒干預(yù)治療后變化趨勢不明顯。
　　結(jié)論:玉屏風顆粒干預(yù)后衛(wèi)氣虛證SD大鼠出現(xiàn)代謝譜的回歸;蘋果酸、環(huán)磷酸腺苷、尿苷在治療后回調(diào)，反證了這三種物質(zhì)作為衛(wèi)氣虛證潛在證候標記物的可靠性;糾正紊亂的氨基酸代謝及磷脂類代謝可能是玉屏風顆粒在分子層面治療衛(wèi)氣虛證的作用機制之一。
　　實驗三:生物種基因Clock、Bm

13、all和Cry1在衛(wèi)氣虛SD大鼠及玉屏風干預(yù)效果的年節(jié)律變化的實驗研究
　　方法:分別在春分、夏至、秋分、冬至前2周將30只SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組和治療組，SD雄性大鼠衛(wèi)氣虛模型組采用疲勞寒熱交替刺激法制備，治療組給予玉屏分散顆粒溶液灌服，正常對照組給予常規(guī)飼養(yǎng)，每日灌服等量等溫純凈水。用RT-PCR法檢測各個季節(jié)大鼠血淋巴細胞鐘基因Clock、Bmall和Cry1表達。
　　結(jié)果:
　　1.與同節(jié)氣正常對

14、照組比較，相應(yīng)模型組大鼠鐘基因Clock表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與春分比較，正常對照組、模型組夏至、秋分、冬至鐘基因Clock表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與夏至、秋分比較，正常對照組、模型組冬至鐘基因Clock表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而夏至、秋分鐘基因Clock表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與同節(jié)氣模型組比較，相應(yīng)治療組大鼠鐘基因Clock表達均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P

15、＜0.05)。
　　2.與同節(jié)氣正常對照組比較，相應(yīng)模型組大鼠鐘基因Bmall表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與春分比較，模型組夏至、秋分、冬至鐘基因Bmall表達降低，正常對照組秋分、冬至鐘基因Bmall表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而夏至表達降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與夏至、秋分比較，正常對照組、模型組冬至鐘基因Bmall表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而夏至、秋分鐘基因

16、Bmall表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與同節(jié)氣模型組比較，相應(yīng)治療組春分、冬至大鼠鐘基因Bmall表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而夏至、秋分鐘基因Bmall表達升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　3.與同節(jié)氣正常對照組比較，相應(yīng)模型組大鼠鐘基因Cry1表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與春分比較，正常對照組、模型組夏至、秋分、冬至鐘基因Cry1表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05

17、)。與夏至、秋分比較，正常對照組、模型組冬至鐘基因Cry1表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而夏至、秋分鐘基因Cry1表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與同節(jié)氣模型組比較，相應(yīng)治療組大鼠鐘基因Cry1表達均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.衛(wèi)氣虛模型大鼠與正常大鼠血淋巴細胞鐘基因Clock表達存在季節(jié)性節(jié)律變化，且兩者變化存在關(guān)聯(lián)性，玉屏風干預(yù)后大鼠鐘基因Clock表達均升高，差異有

18、統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.衛(wèi)氣虛模型大鼠與正常大鼠血淋巴細胞鐘基因Bmal1表達存在季節(jié)性節(jié)律變化，且兩者變化存在關(guān)聯(lián)性。玉屏風干預(yù)后春分、冬至大鼠鐘基因Bmall表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而夏至、秋分鐘基因Bmall表達升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)
　　3.衛(wèi)氣虛模型大鼠與正常大鼠血淋巴細胞鐘基因Cry1表達存在季節(jié)性節(jié)律變化，且兩者變化存在關(guān)聯(lián)性。玉屏風干預(yù)后與同節(jié)氣模型組比較，