食源性單核增生性李斯特氏菌的分布、遺傳多態(tài)性及其毒理機制研究.pdf

1、單核細胞增生性李斯特氏菌(Listeria moncytogenes，Lm)是一種重要的食源性病原菌，由于其具有分布廣、耐受力強、高致病力等特點而備受食品安全領域關注。為了探明保定、石家莊及周邊地區(qū)食源性單增李斯特菌的污染狀況;探明該地區(qū)食源性單增李斯特菌的遺傳多態(tài)性;了解食源性單增李斯特菌的毒力基因分布狀況、毒力基因在其生長周期中不同時間點的表達規(guī)律、在不同宿主條件下毒力基因表達水平以及食源性單增李斯特菌的致病力等情況。本研究對從保定

2、、石家莊及周邊地區(qū)農貿市場、超市采集七大類食品共1288個樣品進行單增李斯特菌的污染調查;對鑒定分離出的308株食源性單增李斯特菌的27個毒力基因的分布情況進行了PCR檢測;采用RAPD法對308株食源性單增李斯特菌的遺傳多態(tài)性進行分析，并采用不加權成對算數(shù)平均法(UPAMA)進行聚類分析;采用實時熒光定量PCR技術(qRT-PCR)對其主要毒力基因的表達量進行了時序性表達研究;采用天然肉湯培養(yǎng)及熒光定量PCR分析法對單增李斯特菌在不同

3、宿主條件下主要毒力基因表達水平進行研究;采用小鼠毒力實驗對一些毒力基因缺失株單增李斯特菌進行致病力實驗。通過本研究得到如下結論:
　　(1)通過對保定、石家莊地區(qū)七大類食品中單增李斯特菌的污染調查表明:單增李斯特菌在該地區(qū)食品中的平均檢出率為23.91％，其中生肉高達40.60％，熟肉制品和水產品分別達到25.42％和23.46％，而其他食品中較少;動物源食品檢出率高于植物源食品。
　　(2)優(yōu)化并建立了單增李斯特菌的RAP

4、D分型方法，得出了308株食源性單增李斯特菌的DNA指紋圖譜，根據(jù)菌株之間的親緣關系制作食源性單增李斯特菌的遺傳進化樹;
　　(3)通過對308株食源性單增李斯特菌的RAPD遺傳多態(tài)性分析，可將308株單增李斯特菌分成6個基因類群，其中第Ⅱ聚類和第Ⅰ聚類為保定、石家莊地區(qū)的優(yōu)勢種群;食源性單增李斯特菌具有一定的寄主偏好性，其傳播流行具有明顯的時間性和地域性;
　　(4)通過對七大類食品中308株單增李斯特菌分離株中的27個毒

5、力基因的PCR檢測發(fā)現(xiàn):與侵入、感染有關的毒力基因在動物源食品分離株中分布明顯高于植物源食品分離株中;與黏附、調控有關的毒力基因在兩者中差別不明顯;該地區(qū)屬于Ⅰ型的單增李斯特菌其毒力基因的平均含量要高于Ⅱ型的菌株;該地區(qū)食源性單增李斯特菌分離株中hfq、dltC和iap檢出率最高，可作為該地區(qū)食源性單增李斯特菌鑒定的參考基因;
　　(5)單增李斯特菌的毒力基因表達量在菌體生長的穩(wěn)定期后期(16h～18 h)達到高峰，以后表達量逐漸

6、降低，但直到菌體生長衰亡期仍保持較高表達量;在豬、雞、牛、羊四種肉湯培養(yǎng)基中毒力基因表達水平差異明顯，表明單增李斯特菌在不同宿主條件下其毒力基因表達量不同;
　　(6)毒理試驗結果表明:hlyA基因對單增李斯特菌的致病力具有決定性作用，inlA、prfA和virR基因對單增李斯特菌的致病力影響較大，而plcA，actA、plcB、dltA、dltD等基因對單增李斯特菌致病力均有影響但相對較小。
　　本論文研究成果將為食源性單