低聲壓次聲對(duì)大鼠顱腦損傷后膠質(zhì)纖維酸性蛋白及生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43表達(dá)的影響.pdf

1、創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)，又稱(chēng)腦外傷，是由外傷引起的腦組織結(jié)構(gòu)和功能?chē)?yán)重?fù)p害的疾病，多發(fā)生于交通事故、摔傷、火器傷等意外事故和自然災(zāi)害等情況，高致殘和致死率給社會(huì)及家庭帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和醫(yī)療護(hù)理負(fù)擔(dān)。腦外傷并非單一的腦組織損傷，它包括外力直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)而引起的原發(fā)性損傷，以及在原發(fā)性損傷的基礎(chǔ)之上，隨著傷后的炎癥反應(yīng)、病理生理變化及出血、腦水腫等因素所引起的繼發(fā)性損傷。其中腦外傷后

2、繼發(fā)性顱腦損傷是造成神經(jīng)元死亡和神經(jīng)功能障礙的主要原因，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶和運(yùn)動(dòng)功能障礙等嚴(yán)重后遺癥。如何預(yù)防和治療腦外傷以及如何最大程度地促進(jìn)神經(jīng)功能的修復(fù)，降低腦外傷后功能障礙的發(fā)生率已成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。目前，對(duì)腦外傷的治療，臨床上多采用防治腦水腫、降低顱內(nèi)壓和冬眠低溫等保守治療方法，然而中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)效果并不滿(mǎn)意?？祻?fù)治療的早期介入已日益受到廣大醫(yī)務(wù)人員重視，并且已取得了明顯的療效。積極尋求有效的促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的干預(yù)方

3、法，已成為現(xiàn)在康復(fù)醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)，而且具有相當(dāng)大的社會(huì)意義及可觀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
　　物理治療是康復(fù)治療的重要手段之一，次聲作為眾多物理因子中的一種，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中現(xiàn)階段應(yīng)用仍較少。次聲，即頻率為0.0001Hz～20 Hz的機(jī)械振動(dòng)波，在自然界中廣泛存在。次聲的頻率低，波長(zhǎng)長(zhǎng)，故在傳播過(guò)程中不易被介質(zhì)吸收，因此具有很強(qiáng)的穿透力，且在大氣中具有衰減小，傳播遠(yuǎn)的特性。次聲的生物學(xué)效應(yīng)與其強(qiáng)度有關(guān)，研究證明，高于90dB的次聲對(duì)生物體有損害

4、作用，而強(qiáng)度低于90dB的次聲，即低聲壓級(jí)次聲，具有腦保護(hù)及促進(jìn)神經(jīng)再生的作用。生理學(xué)研究結(jié)果表明，人體內(nèi)器官存在一個(gè)固定的振動(dòng)頻率，頭部為8-12HZ、內(nèi)臟為4-8 HZ，心臟為4-6 HZ，這些固有頻率都在次聲頻率范圍內(nèi)，可引起機(jī)體產(chǎn)生共振作用。近年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，低聲壓級(jí)次聲可與生物體產(chǎn)生緩慢而輕柔的共振作用，其還可以產(chǎn)生力學(xué)、熱學(xué)、光學(xué)、電學(xué)等多種物理效應(yīng)，因此，地聲壓級(jí)次聲次聲不僅不會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生損傷，還可以對(duì)生物產(chǎn)生深部按摩作用

5、，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)酶活性，增高代償反應(yīng)。由于次聲的頻率很低，所以大氣對(duì)次聲波的吸收系數(shù)很小，因而其穿透力極強(qiáng)，可傳播至極遠(yuǎn)處而能量衰減很小，因此它的穿透力較強(qiáng)，能在人體內(nèi)很好的傳播，可穿透致病態(tài)組織（細(xì)胞）內(nèi)，使病態(tài)組織內(nèi)閉塞的血管重新開(kāi)放，改善病態(tài)組織內(nèi)的血液循環(huán)，為促進(jìn)氧氣、吞噬細(xì)胞、免疫球蛋白等物質(zhì)向病變組織輸送提供了有利條件。
　　本實(shí)驗(yàn)小組前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，低聲壓級(jí)次聲可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存活素的表達(dá)，從而促進(jìn)BM

6、SCs的增殖，抑制其凋亡;在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用低聲壓級(jí)次聲作用于腦缺血再灌注大鼠可刺激胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)分泌和促進(jìn)大鼠腦缺血周?chē)切文z質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，從而使大鼠梗死面積縮小，神經(jīng)癥狀明顯改善。故據(jù)此推測(cè)，低聲壓級(jí)次聲可能對(duì)腦外傷也具有治療作用。前期的研究中發(fā)現(xiàn)連續(xù)作用7天可達(dá)到較好的治療效果，故本研究選擇連續(xù)干預(yù)7天。然而次聲作用后的影響和生物效應(yīng)與次聲的參數(shù)有關(guān)，每天作用時(shí)間的長(zhǎng)短不同，所得的結(jié)果也不同。故本次實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研

7、究了次聲在60min、90min、120min干預(yù)時(shí)間對(duì)大鼠腦外傷后作用影響。
　　顱腦損傷后，腦組織內(nèi)神經(jīng)元標(biāo)志物會(huì)發(fā)生改變，通過(guò)觀察這些標(biāo)志物的變化可以評(píng)估顱腦損傷后修復(fù)的程度。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial FibrillaryAcidic Protein GFAP)是星形膠質(zhì)細(xì)胞骨架的中間絲蛋白，在星形細(xì)胞中有豐富而特異性的表達(dá)，參與神經(jīng)損傷的修復(fù)與再生，是星形細(xì)胞活化的客觀標(biāo)志蛋白之一，對(duì)于維持星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定至

8、關(guān)重要，并決定著星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)損傷反應(yīng)的程度，是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物。星形膠質(zhì)細(xì)胞可分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，從而保護(hù)受損神經(jīng)元，增加突觸的聯(lián)系，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)及神經(jīng)功能恢復(fù)。星形膠質(zhì)細(xì)胞還可以維持離子平衡、調(diào)節(jié)能量代謝、對(duì)抗氧化應(yīng)激。生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43（Growth associated protein-43 GAP-43）是一種神經(jīng)特異性的蛋白質(zhì)，對(duì)神經(jīng)纖維

9、生長(zhǎng)、發(fā)育、再生以及突觸功能維持和遞質(zhì)釋放都起重要作用。GAP-43在神經(jīng)發(fā)育和損傷修復(fù)過(guò)程中高水平表達(dá)，可調(diào)節(jié)軸突延伸作用，改變細(xì)胞形態(tài)，對(duì)軸突生長(zhǎng)和突觸建立有重要作用，被認(rèn)為是神經(jīng)元發(fā)育和再生的內(nèi)在決定因子。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)大鼠顱腦外傷后予以低聲壓級(jí)次聲干預(yù)，觀察大鼠mNSS評(píng)分及結(jié)合病理組織學(xué)、免疫組織化學(xué)染色法觀察大鼠顱腦外傷后膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)及生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(GAP-43)表達(dá)的影響，探

10、討次聲對(duì)大鼠腦損傷后神經(jīng)組織保護(hù)修復(fù)的影響及相關(guān)治療機(jī)理。
　　方法：
　　1.動(dòng)物及分組
　　健康Sprague-Dawley雄性大鼠30只，體重200-250 g，室溫、常濕飼養(yǎng)，普通飼料，自由飲水。將30只SD大鼠隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組(n=6)、模型組(n=6)、次聲60min組(n=6)、次聲90min組(n=6)和次聲120min組(n=6)。
　　2.腦外傷動(dòng)物模型的制備
　　采用Fee

11、ney法[61]制作顱腦外傷模型，用1％戊巴比妥鈉(30mg/kg)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔注射麻醉后，將大鼠頭部固定于解剖板上，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，沿頭正中切開(kāi)頭皮，剝離骨膜，暴露左側(cè)頂骨，于冠狀縫后1.5mm、矢狀縫旁2.5mm鉆一骨孔，咬除顱骨，直至形成一直徑為5mm骨窗，顯露硬腦膜。在硬腦膜上放置一與骨孔大小吻合的墊片，用20g砝碼于30cm高處沿外周導(dǎo)管墜落，直接撞擊撞墊進(jìn)行一次打擊(撞擊能量為600g·cm)，造成左項(xiàng)葉腦挫裂傷。打

12、擊后用雙氧水、生理鹽水反復(fù)沖洗傷口。硬膜外置明膠海綿止血，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于37℃恒溫板復(fù)溫，致麻醉清醒后放回籠中。假手術(shù)組除了不造成顱腦外傷外，其余步驟同模型組及次聲組。
　　3.納入及剔除標(biāo)準(zhǔn):
　　在規(guī)定缺血時(shí)限內(nèi)（術(shù)后2-3h）按Zea Longa5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分:0分，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀;1分，不能伸展對(duì)側(cè)前爪;2分，向外側(cè)劃圈;3分，向?qū)?cè)傾倒;4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。1分以上視為造模成功

13、。如未出現(xiàn)右側(cè)肢體癱瘓（0分）或已死亡的動(dòng)物被剔除。隨機(jī)補(bǔ)充剔除標(biāo)本，保證最終納入分析的動(dòng)物共30只。
　　4.處理方法
　　次聲組按次聲干預(yù)時(shí)間的長(zhǎng)短隨機(jī)分成60分鐘組、90分鐘組、120分鐘組，分別給予次聲干預(yù)60分鐘、90分鐘、120分鐘，每天1次，連續(xù)7天。模型組干預(yù)過(guò)程中除不開(kāi)機(jī)外，其余過(guò)程同次聲組。假手術(shù)組只打開(kāi)顱窗，不損傷腦組織，不進(jìn)行次聲干預(yù)。
　　5.療效評(píng)價(jià)
　　術(shù)后第7天對(duì)納入分析的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

14、按照改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(modifiedNeurological Severity Scores，mNSS)進(jìn)行評(píng)分，最后取腦片行HE染色及免疫組織化學(xué)染色，觀察各組大鼠腦損傷周?chē)M織病理改變及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillaryacidic protein，GFAP)及生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(Growth associated protein-43)表達(dá)的變化。
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)以(

15、(x)±s)表示，各組mNSS評(píng)分和IOD值采用方差分析，組間兩兩比較比較采用LSD法，以P＜0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　　次聲3組與模型組的mNSS評(píng)分均存在差異(P＜0.05)，次聲三組間的mNSS評(píng)分無(wú)差異(P＞0.05);免疫組化結(jié)果:①五組間的GFAP表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，模型組與假手術(shù)組比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，3個(gè)次聲組GFAP的IOD值與模型組比較均存在差異(P＜0

16、.05)，3個(gè)次聲組間GFAP表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。②五組間的GAP-43表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，模型組與假手術(shù)組比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，3個(gè)次聲組GAP-43的IOD值與模型組比較均存在差異(P＜0.05)，3個(gè)次聲組間GAP-43表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、低聲壓級(jí)次聲治療能夠顯著降低神經(jīng)功能評(píng)定總分，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。
　　2、低聲壓級(jí)次聲可促進(jìn)大鼠腦外