吡喃糖氧化酶和漆酶在木質(zhì)素生物降解中作用的研究.pdf

1、木質(zhì)素是由苯丙烷結(jié)構(gòu)單元通過(guò)碳碳鍵和醚鍵連接而成的天然高分子聚合物。它是自然界中含量?jī)H次于纖維素的第二大可再生有機(jī)資源。木質(zhì)素非常難以降解，在植物細(xì)胞壁中，它與半纖維素一起包裹著纖維素，對(duì)植物起保護(hù)作用。木質(zhì)素的降解是自然界碳素循環(huán)的限速步驟。然而，對(duì)于生物質(zhì)資源的利用，木質(zhì)素的存在是一個(gè)障礙。木質(zhì)素的生物降解是實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)資源有效利用的一條重要途徑。白腐真菌是自然界中唯一能夠徹底將木質(zhì)素分解為CO2和H2O的生物。木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（Li

2、P）、錳過(guò)氧化物酶(MnP)和漆酶是白腐真菌產(chǎn)生的主要木質(zhì)素降解酶。然而，這些酶在胞外很難實(shí)現(xiàn)對(duì)天然木質(zhì)素的徹底降解，反而更傾向于導(dǎo)致木質(zhì)素的聚合。這說(shuō)明白腐真菌在體內(nèi)必定有一套人們尚未發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)木質(zhì)素聚合和降解的機(jī)制。
　　吡喃糖2-氧化酶(P2O)在白腐真菌中廣泛存在。它可以氧化多種吡喃糖C-2位產(chǎn)生相應(yīng)的酮糖，同時(shí)將O2還原為H2O2。P2O在白腐真菌中的作用被認(rèn)為是為過(guò)氧化物酶提供H2O2。有研究表明，對(duì)于P2O，一些醌類(lèi)

3、和自由基是比O2更好的電子受體。鑒于此，P2O可能通過(guò)還原木素降解過(guò)程中產(chǎn)生的自由基和醌類(lèi)中間體來(lái)抑制它們的聚合，與木質(zhì)素降解酶協(xié)同作用，促進(jìn)木質(zhì)素的降解。但這個(gè)推測(cè)尚未得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)。因此，本研究的目的之一就是探討P2O和漆酶在木質(zhì)素降解中的協(xié)同作用。
　　漆酶能對(duì)多種底物進(jìn)行單電子氧化，這使其在制漿造紙、廢水處理、有機(jī)合成等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域有誘人的應(yīng)用前景。最近，漆酶在木質(zhì)素改性，促進(jìn)木質(zhì)素的高值化利用方面也引起了人們的關(guān)注。尋找適

4、合工業(yè)應(yīng)用的漆酶是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室保存了大量的白腐真菌菌種資源，其中Trametes trogii YDHSD是一株非常高效的漆酶產(chǎn)生菌。本論文對(duì)T.trogii漆酶進(jìn)行了分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，并探討了它在堿木素改性和染料脫色中的應(yīng)用。本論文的主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.吡喃糖-2-氧化酶(P2O)的分離純化和表征
　　使用硫酸銨分級(jí)沉淀、疏水層析、陰離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析等方法從白腐真菌Irpex la

5、cteus dft-1中分離純化得到一種氧化葡萄糖并產(chǎn)H2O2的酶，純化倍數(shù)27.9，得率27.4％。經(jīng)TLC和GC-MS分析，該酶氧化葡萄糖的產(chǎn)物為2-酮-D-葡萄糖，從而確定該酶為P2O，而非葡萄糖-1-氧化酶。凝膠過(guò)濾顯示該酶分子量為266 kDa，SDS-PAGE顯示亞基分子量為71 kDa，表明該酶有4個(gè)亞基。該酶表現(xiàn)出典型黃素蛋白的紫外可見(jiàn)光譜特征。該酶的最適pH為6.5，最適溫度為55℃，在較寬的pH范圍（5-11）和溫度

6、范圍內(nèi)（低于60℃）都非常穩(wěn)定。D-葡萄糖、D-半乳糖、L-山梨糖、D-木糖和D-葡萄糖酸-1，5-內(nèi)酯等多種單糖都可被該酶氧化，少數(shù)雙糖，比如麥芽糖和纖維二糖也能被I.lacteus P2O氧化。對(duì)這些糖類(lèi)底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Kcat的測(cè)定表明，D-葡萄糖是該酶的最適底物。P2O不僅對(duì)其電子供體具有非特異性，對(duì)電子受體也表現(xiàn)出非特異性。除了O2，對(duì)苯醌、甲基對(duì)苯醌、2，6-二甲基對(duì)苯醌、DCIP等醌類(lèi)物質(zhì)和ABTS陽(yáng)離子自由基也可以

7、作為P2O的電子受體。根據(jù)動(dòng)力學(xué)參數(shù)判斷，某些醌類(lèi)甚至比O2更容易被P2O還原。自由基和醌類(lèi)是木質(zhì)素降解的重要中間產(chǎn)物。P2O還原醌類(lèi)底物的特性可能在木質(zhì)素的生物降解中起重要作用。
　　2.P2O和漆酶在木質(zhì)素降解中的協(xié)同作用研究
　　使用分光光度法發(fā)現(xiàn)漆酶可以氧化2，6-DMP、愈創(chuàng)木酚、兒茶酚等酚類(lèi)化合物和木素磺酸鹽，產(chǎn)生醌類(lèi)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致特定波長(zhǎng)下的吸光度增加。P2O的加入可以還原反應(yīng)生成的這些醌類(lèi)物質(zhì)。為了研究P2O和漆

8、酶在木質(zhì)素生物降解中的協(xié)同作用，對(duì)四種工業(yè)木質(zhì)素，即木素磺酸鹽、堿木素、蔗渣CEL、桉木CEL，分別進(jìn)行漆酶單獨(dú)處理和漆酶與P2O共同處理。使用GPC分析了酶作用后的木質(zhì)素的分子量分布。結(jié)果表明，在漆酶的作用下，木質(zhì)素發(fā)生了聚合，分子量增大。然而，P2O的加入有效地抑制了聚合，甚至引起木素磺酸鹽的降解。另外，紅外光譜分析表明單獨(dú)漆酶處理對(duì)木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)影響不大。而當(dāng)P2O與漆酶協(xié)同處理時(shí)，木質(zhì)素中的共軛羰基含量顯著增加，這很有可能是木質(zhì)素

9、結(jié)構(gòu)單元中Cα氧化的結(jié)果。這表明，P2O的加入促進(jìn)了漆酶對(duì)木質(zhì)素的氧化。
　　以上結(jié)果說(shuō)明，P2O能夠還原木質(zhì)素氧化過(guò)程中產(chǎn)生的自由基和醌類(lèi)中間體，從而抑制漆酶催化的木質(zhì)素的聚合，并能在一定程度上促進(jìn)木質(zhì)素的氧化降解。除了為L(zhǎng)iP和MnP提供H2O2，抑制木質(zhì)素降解碎片的再聚合可能是P2O的另外一個(gè)生理功能。鑒于P2O在白腐真菌中的廣泛分布，P2O與漆酶或過(guò)氧化物酶協(xié)作維持一種氧化還原循環(huán)，可能是白腐真菌用來(lái)調(diào)控木質(zhì)素聚合和降解的

10、一種通用機(jī)制。
　　3.漆酶的分離純化和表征
　　利用硫酸銨分級(jí)沉淀、陰離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析等手段，從白腐真菌T.trogii YDHSD中分離純化得到一種藍(lán)漆酶。該酶是一個(gè)單體蛋白，根據(jù)SDS-PAGE測(cè)定的分子量為64 kDa。該酶對(duì)不同底物的最適pH在2.2到4.5范圍內(nèi)，最適溫度為70℃。該漆酶表現(xiàn)出較高的熱穩(wěn)定性，60℃半衰期為1.6小時(shí)。該漆酶底物范圍非常廣泛，一系列酚類(lèi)化合物都能被其氧化。另外，該漆酶能在

11、不加介體的情況下直接氧化非酚型偶氮染料甲基紅。根據(jù)其動(dòng)力學(xué)參數(shù)判斷，ABTS是該漆酶的最適底物。與其它漆酶相比，該漆酶對(duì)ABTS和丁香醛連氮有非常高的親和力。而且，該漆酶具有良好的金屬離子耐受性。這些優(yōu)良特性說(shuō)明T.trogii漆酶具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景。
　　4.漆酶對(duì)堿木素的改性
　　GPC分析表明T.trogii該漆酶可以有效地氧化堿木素導(dǎo)致其聚合。堿木素聚合反應(yīng)的最適pH在6到6.5范圍內(nèi)。在pH6.5的緩沖液中，經(jīng)

12、漆酶處理后24 h后，堿木素的重均分子量增大了5.4倍。FTIR、元素分析和1H NMR分析表明，漆酶處理導(dǎo)致堿木素的官能團(tuán)發(fā)生改變。經(jīng)漆酶氧化聚合，堿木素中的羰基和脂肪族羥基含量增加，甲氧基含量減少。酚羥基含量少量增加。此外，木素氧化過(guò)程中縮合結(jié)構(gòu)含量增加。這些結(jié)果表明，T.trogii漆酶在木質(zhì)素改性中具有潛在的的應(yīng)用價(jià)值。
　　5.漆酶在染料脫色中的應(yīng)用
　　T.trogii漆酶可以在不加介體的情況下直接對(duì)多種染料氧化