RARα和NLS-RARα蛋白的細胞生物學功能分析及其作為轉錄因子的實驗研究.pdf

1、第一部分攜帶RARα基因的重組腺病毒表達質粒的構建及其對人白血病細胞的影響
　　目的：用AdEasy系統(tǒng)構建人RARα基因重組腺病毒表達質粒,感染人白血病細胞株NB4后用一定濃度的全反式維甲酸ATRA誘導,觀察其對白血病細胞株增殖、分化和凋亡的影響，同時與變異型NLS-RARα的細胞生物學功能相比較，觀察二者的生物學功能差異。
　　方法：以白血病細胞株NB4的cDNA為模板，PCR擴增RARα基因，克隆至穿梭質粒pAdTra

2、ce-TO4中,構建重組腺病毒穿梭質粒pAdTrace-TO4-RARα。用限制性內切酶EcoR V和Sal I雙酶切及測序鑒定，然后轉化含有骨架質粒AdEasy-1的大腸桿菌BJ5183菌株的感受態(tài)，同源重組獲得重組腺病毒質粒Ad-RARα。酶切驗證后，限制性內切酶Pac I酶線性化后轉染HEK293細胞，包裝出重組腺病毒Ad-RARα，經(jīng)3輪擴增后，測定病毒滴度，進行PCR鑒定。流式細胞術測定病毒感染效率，Western blot法

3、檢測重組腺病毒感染的人NB4細胞中RARα蛋白，CCK-8法檢測重組腺病毒感染對NB4細胞增殖的影響，Annexin V/PI雙染法測定細胞周期，PI測定細胞凋亡，Western blot法檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2的表達。
　　結果：重組腺病毒穿梭質粒pAdTrace-TO4-RARα構建成功，病毒感染效率可達70％,與對照組的NB4細胞相比,重組腺病毒感染的NB4細胞內RARα蛋白的表達明顯升高(P<0.05),且經(jīng)一

4、定濃度全反式維甲酸ATRA處理后,能夠有效地促進感染重組腺病毒細胞的分化成熟和凋亡，變異蛋白NLS-RARα與之相比，NLS-RARα亦能促進白血病細胞增殖，抑制分化。
　　結論：變異蛋白NLS-RARα與野生型RARα在白血病細胞株中過表達后均能促進細胞增殖，抑制細胞分化，在經(jīng)一定濃度的維甲酸誘導后均能促進細胞分化成熟和凋亡，故得出結論：變異蛋白NLS-RARα與野生型RARα的細胞生物學功能相似，NLS-RARα可能通過與野生

5、型RARα類似的功能影響白血病細胞株的細胞生物學功能。
　　第二部分RARα和NLS-RARα的結合位點及轉錄調控的研究
　　目的：通過研究NLS-RARα的結合位點，與RARα的結合位點相比較，證明NLS-RARα為一個變異的轉錄因子，可能與RARα競爭性結合某些基因而參與到APL的發(fā)生中。
　　方法：構建維甲酸受體α（RARα）、視黃醛受體α（RXRα）及變異蛋白NLS-RARα的真核表達質粒，通過間接免疫熒光（I

6、FF）觀察 RARα、RXRα和 NLS-RARα的核漿分布，然后用免疫共沉淀（Co-IP）分別檢測RARα、NLS-RARα同RXRα是否有相互作用；凝膠電泳遷移率實驗（EMSA）檢測RARα、NLS-RARα結合維甲酸反應元件DNA探針的能力；最后用熒光素酶報告實驗檢測RARα和NLS-RARα調控維甲酸反應元件活性的程度。
　　結果：維甲酸受體α（RARα）、視黃醛受體α（RXRα）的真核表達質粒構建成功；間接免疫熒光結果顯

7、示，與 RARα相比， NLS-RARα更多地分布在細胞核內；免疫共沉淀和 Native-PAGE結果顯示NLS-RARα與RXRα有相互作用，并能夠形成二聚體；凝膠電泳遷移率實驗和熒光素酶報告實驗證明NLS-RARα能夠結合維甲酸反應元件DNA探針及調控其轉錄活性。
　　結論：該研究成功地構建了RARα、RXRα的真核表達質粒，并證明NLS-RARα有轉錄活性，NLS-RARα可能作為一個變異的轉錄因子參與影響白血病細胞株的增殖