兔跟腱急性損傷修復(fù)術(shù)后持續(xù)牽張應(yīng)力刺激促進(jìn)肌腱修復(fù)及其作用機(jī)理研究.pdf

1、肌腱是連接骨和肌肉的致密結(jié)締組織，其在肌肉和骨之間具有傳遞動(dòng)能的作用，由于肌腱細(xì)胞周圍包裹有縱行排列的膠原纖維束，因此肌腱具有較強(qiáng)的抗拉強(qiáng)度。但是肌腱組織鑒于這種力學(xué)強(qiáng)度較高的組織結(jié)構(gòu)，其血管比例較少，因此損傷后不利于組織的修復(fù)和再生。臨床上治療肌腱急性斷裂或損傷常常采用外科手術(shù)來(lái)修復(fù)。隨著縫合方法的不斷改進(jìn)，以及縫合材料的迅猛發(fā)展，肌腱縫合后的再斷裂率顯著下降。但對(duì)于肌腱損傷修復(fù)后的固定方法，以往的臨床經(jīng)驗(yàn)則是采用非功能位的固定，即松

2、弛位，主要考慮到縫合后早期受力會(huì)使得縫合處的肌腱再斷裂或者近端和遠(yuǎn)端鏈接較差。但隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，功能位固定的提出也是對(duì)傳統(tǒng)方法的一種挑戰(zhàn)。功能位固定使得肌腱修復(fù)后處于持續(xù)的溫和牽張刺激中。以往的實(shí)驗(yàn)研究表明，體外離體對(duì)跟腱、髕腱等進(jìn)行牽拉刺激后，其膠原含量較未施加牽拉刺激的水平高。那么功能位固定的這種能夠?qū)π迯?fù)后的肌腱產(chǎn)生持續(xù)牽張應(yīng)力刺激能否對(duì)肌腱的修復(fù)帶來(lái)益處，它加速肌腱組織修復(fù)的機(jī)制則是本文研究的重點(diǎn)。闡明其潛在的機(jī)理，有利于將

3、功能位固定更廣泛的應(yīng)用于肌腱損傷修復(fù)后，為臨床提供新的治療方法和手段。
　　目的:
　　探討兔跟腱急性離斷修復(fù)后功能位固定對(duì)其修復(fù)效果的影響以及其潛在的作用機(jī)理。
　　方法:
　　本研究分兩部分進(jìn)行。第一部分為探討兔跟腱急性損傷修復(fù)術(shù)后持續(xù)牽張應(yīng)力刺激對(duì)跟腱的生物力學(xué)和相關(guān)生長(zhǎng)因子表達(dá)影響。第二部分為探討持續(xù)牽張應(yīng)力刺激對(duì)肌腱干細(xì)胞向肌腱細(xì)胞定向分化的研究。
　　第一部分，研究對(duì)象為成年健康雄性新西蘭白兔，

4、隨機(jī)分為4組，每組42只，即A、B、C和D組。A組給予跟腱離斷縫合術(shù)后踝關(guān)節(jié)功能位固定。B組給予松弛位固定。C組不給于固定，自由活動(dòng)。D組為正常對(duì)照組。選擇術(shù)后第7d、14d、28d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)各組兔跟腱修復(fù)組織力學(xué)性能，HE、苦味酸-－天狼猩紅染色觀察修復(fù)的肌腱組織形態(tài)及膠原分布，彩超觀察各組跟腱組織的術(shù)后7d，14d和28d的相關(guān)指標(biāo)。透射電鏡觀察各組跟腱組織術(shù)后28d時(shí)的超微結(jié)構(gòu)。采用實(shí)時(shí)定量PCR和ELISA法檢測(cè)修復(fù)肌腱組織

5、的相關(guān)基因和蛋白的水平。第二部分，體外分離培養(yǎng)兔跟腱肌腱干細(xì)胞，采用成骨、成軟骨、成脂肪等誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)并染色鑒定其多向分化潛能。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分離的肌腱干細(xì)胞特征性蛋白水平。采用持續(xù)牽張應(yīng)力刺激儀對(duì)體外分離培養(yǎng)的肌腱干細(xì)胞進(jìn)行2％strain、4% strain和6% strain的持續(xù)牽張應(yīng)力刺激。在施加刺激后24h和48h時(shí)檢測(cè)細(xì)胞成肌腱分化相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　第一部分，術(shù)后28d時(shí)A組跟腱損

6、傷處可見(jiàn)大量膠原纖維形成，纖維排列較整齊，炎性細(xì)胞較少見(jiàn)到。C組兔跟腱修復(fù)處也可見(jiàn)有大量膠原纖維形成，纖維結(jié)構(gòu)排列比A組較差。術(shù)后第7d、14、28d時(shí)，四組兔跟腱最大載荷、抗拉剛度、最大斷裂應(yīng)力差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），A組均優(yōu)于B組和C組（P＜0.05）。第28d時(shí)A組最大載荷、抗拉剛度、最大斷裂應(yīng)力的值分別為269.32±28.43(N)，25.63±1.43(N/mm)和9.78±2.53（Mpa）。在第28d時(shí)，A

7、組兔跟腱Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的比例均已非常接近正常兔跟腱，然而 C組的Ⅰ型膠原比例略低于A組，B組最低，僅為86.32%。術(shù)后第7d時(shí)，A組兔跟腱組織中，COL I、COLⅢ、TGF-β1、bFGF、PDGF和IGF-1基因表達(dá)水平顯著升高。高于B組、C組和D組，而A組VEGF表達(dá)量較B組和C組低（P＜0.05）。在術(shù)后第28d時(shí)，各組COL I、COLⅢ、TGF-β1、bFGF、PDGF、VEGF和IGF-1基因表達(dá)水平均有不同程度的下

8、降，但仍高于D組水平（P＜0.05）。ELISA檢測(cè)蛋白水平結(jié)果顯示術(shù)后第7d時(shí)，A組COL I、TGF-β1、bFGF、PDGF蛋白水平顯著高于B組和C組（P＜0.05）。而四組VEGF和IGF-1蛋白水平差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)后第14d時(shí)，A組和C組COL I、bFGF和PDGF蛋白水平又有所上升，且顯著高于B組（P＜0.05）。
　　第二部分，肌腱干細(xì)胞呈鵝卵石樣平鋪于培養(yǎng)瓶底，并且呈克隆樣生長(zhǎng)。番紅O、茜素

9、紅和油紅O染色顯示肌腱干細(xì)胞具有向成軟骨、成骨和成脂分化的潛能。2%牽張應(yīng)力下，肌腱干細(xì)胞在24h時(shí)I型膠原和Ⅲ型膠原基因表達(dá)有明顯的上升，然而在48h時(shí)，其這兩個(gè)基因表達(dá)未見(jiàn)明顯變化（P＞0.05），而TNC和SCX兩個(gè)肌腱細(xì)胞標(biāo)志性基因及蛋白在48h時(shí)反而表達(dá)水平下降。在4%持續(xù)牽張應(yīng)力刺激下COL I、COLⅢ、TNC和 SCX均有顯著的上升，并且48h時(shí)表達(dá)水平也高于24h時(shí)（P＜0.05）。而6%的持續(xù)牽張應(yīng)力刺激未能使肌腱干

10、細(xì)胞的COL I、COLⅢ、TNC和 SCX基因及蛋白表達(dá)顯著升高，顯著低于2%和4%持續(xù)牽張應(yīng)立組（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、兔跟腱急性斷裂修復(fù)后功能位固定較非功能位固定更能夠促進(jìn)肌腱組織膠原含量的增加以及纖維結(jié)構(gòu)的恢復(fù)。
　　2、兔跟腱急性斷裂修復(fù)后功能位固定較非功能位固定更能夠促進(jìn)修復(fù)跟腱組織生物力學(xué)性能的提高。
　　3、兔跟腱急性斷裂修復(fù)后功能位固定較非功能位固定更能夠促進(jìn)修復(fù)跟腱組織的肌腱相