PITX2、β-catenin在卵巢上皮性癌中的表達(dá)及意義.pdf

1、卵巢上皮性癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的三大惡性腫瘤之一，死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首。卵巢深居盆腔，卵巢上皮性癌起病比較隱匿，由于缺乏早期診斷方法，70％～80％已屬晚期，極易發(fā)生轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，然而即使完善的腫瘤減滅術(shù)之后，病人的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍很高，五年存活率仍徘徊在30%-40%左右。卵巢上皮性癌已成為嚴(yán)重威脅婦女生命的惡性腫瘤。
　　PITX2全稱(chēng)為“垂體同型框2”(pituitary homeobox2),定位于染色體4q25-26，是同

2、型框基因bicoid相關(guān)家族的一員，因最初發(fā)現(xiàn)在垂體發(fā)育中發(fā)揮作用而得名，在脊椎動(dòng)物的垂體、大腦、心臟、牙齒等發(fā)育過(guò)程中起到重要作用。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，PITX2基因突變可能與多種疾病有關(guān)，如：里格爾綜合征(axenfeld-Riegersyndrome)、虹膜發(fā)育不全(iridogoniodysgenesis syndrome)和零星彼得綜合征(sporadic Peter syndrome)等，但是越來(lái)越多的資料表明PITX2的異常激

3、活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，例如：大腸癌、前列腺癌、乳腺癌、甲狀腺瘤等。
　　既往大量研究顯示W(wǎng)nt信號(hào)通路在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。2002年Kioussi等在垂體腺瘤中研究表明當(dāng)Wnt信號(hào)通路被激活時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞表面Fz受體以及共同受體結(jié)合后，從而抑制β-catenin-Axin-APC-GSK-3β復(fù)合物的形成，使GSK-3β失活，β-catenin不能被GSK-3β磷酸化而不被降解，逐漸積聚進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)

4、錄因子 TCF/LEF相結(jié)合，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的下游靶基因PITX2，從而促進(jìn)PITX2下游靶基因如C-myc、Cyclin D1、Cyclin D2等的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖或活化，最終促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。PITX2是Wnt信號(hào)通路的下游基因，并受Wnt/Dvl/β-catenin的調(diào)節(jié)，但是在卵巢上皮性癌中PITX2異常激活是否與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)仍不清楚。
　　目的
　　本研究通過(guò)從組織水平和細(xì)胞水平上對(duì)

5、PITX2和β-catenin進(jìn)行研究，探討PITX2與卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系以及PITX2在卵巢上皮性癌中異常高表達(dá)是否受Wnt/β-catenin調(diào)控。
　　材料和方法
　　1．研究對(duì)象：
　　1.1臨床標(biāo)本收集2012年9月-2014年12月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院、第一附屬醫(yī)院的手術(shù)標(biāo)本114例，患者年齡16歲到70歲,中位年齡54歲，根據(jù)組織的良惡程度將標(biāo)本分為3組：卵巢上皮性癌42例（惡性組)；卵巢

6、上皮性良性腫瘤37例（良性組），正常卵巢組織35例（正常組）；組織標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋。42例卵巢上皮性癌患者、37例卵巢上皮良性腫瘤、35例非卵巢腫瘤患者血清標(biāo)本，采血時(shí)間均為早上6點(diǎn)到8點(diǎn)，室溫下血液靜置20 min，4℃下3000r／min離心20min，取上清置于EP管，-80℃冰箱保存。所有病例均未合并其他腫瘤病史，術(shù)前、術(shù)后均未接受放、化療，取材前均與患者及家屬溝通并獲得其知情同意，術(shù)后均經(jīng)病理科確診。
　　

7、1.2細(xì)胞株 SKOV3、OVCAR3兩株細(xì)胞來(lái)自于美國(guó)ATCC，兩細(xì)胞株培養(yǎng)均使用1640培養(yǎng)基（含10%滅火胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/L鏈霉素），在37.5℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)期后分別加入Wnt通路抑制劑DKK130 ng/ml。細(xì)胞分組：SKOV3空白對(duì)照組、SKOV3+DKK1抑制劑組、OVCAR3空白對(duì)照組、OVCAR3+DKK1抑制劑組。
　　2．研究方法：a.運(yùn)用免疫組織化學(xué)S

8、P法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q-PCR）方法分別檢測(cè)不同卵巢組織中PITX2和β-catenin蛋白和mRNA的表達(dá)。b.運(yùn)用Elisa法檢測(cè)不同卵巢疾病患者血清中PITX2蛋白的表達(dá)。c.運(yùn)用MTT法和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV3、OVCAR3兩株細(xì)胞在加入Wnt通路抑制劑DKK1前后細(xì)胞的增殖能力和遷移能力。d.運(yùn)用Q-PCR和Western bolt分別檢測(cè)SKOV3、OVCAR3兩株細(xì)胞在加入Wnt通路抑制劑DKK1前后PITX2和

9、β-catenin蛋白和mRNA的表達(dá)。
　　3．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)比較正常組、良性組、惡性組中PITX2和β-catenin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率以及兩種蛋白在惡性組中與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。在正常組、良性組、惡性組中PITX2和β-catenin mRNA的表達(dá)水平采用單因素方差進(jìn)行分析，組與組之間兩兩比較采用LSD-t法。應(yīng)用Pearson列聯(lián)系數(shù)進(jìn)行分析在卵巢上皮性癌組織中PIT

10、X2和β-catenin蛋白表達(dá)的相關(guān)性。兩獨(dú)立樣本均數(shù)之間比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)采用α=0.05，組間兩兩比較時(shí)檢驗(yàn)水準(zhǔn)采用α′=α/比較次數(shù)=0.0167。
　　結(jié)果
　　1．根據(jù)組織免疫化學(xué)染色結(jié)果PITX2蛋白陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)。PITX2蛋白在正常組中，良性組中以及惡性組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為14.3%（5/35）、16.2%（6/37）、83.3%（35/42），其中惡性組中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常組和良性組（P

11、<0.0167），正常組與良性組相比無(wú)明顯差異（P>0.0167)。
　　2．卵巢上皮性癌組織中，PITX2蛋白表達(dá)與卵巢上皮性癌的FIGO分期、組織分化程度以及淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）；與患者年齡無(wú)關(guān)（P>0.05）。
　　3． PITX2蛋白在正常組、良性組、惡性組患者血清中的表達(dá)量分別為7.25±2.24ng.mL-1、7.83±1.9ng.mL-1、12.18±2.38ng.mL-1，惡性組患者血清中PIT

12、X2蛋白的表達(dá)量明顯高于良性組和正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），正常組與良性組之間無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　4． PITX2 mRNA在正常組、良性組、惡性組中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.128±0.087、0.167±0.106、0.405±0.126，惡性組中PITX2的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常組和良性組（ P<0.001），但正常組與良性組之間無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　5．根據(jù)組織免疫化學(xué)染

13、色結(jié)果β-catenin蛋白陽(yáng)性異位表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。β-catenin蛋白在正常組、良性組、惡性組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為5.7%（2/35）、10.8%（4/37）、85.7%（36/42），惡性組中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常組和良性組（P<0.0167），正常組與良性組相比無(wú)明顯差異（P>0.0167)。
　　6．卵巢上皮性癌組織中，β-catenin蛋白的異位表達(dá)與卵巢上皮性癌的FIGO分期、組織分化程度以及淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<

14、0.05）；與患者年齡無(wú)關(guān)（P>0.05）。
　　7．β-catenin mRNA在正常組、良性組、惡性組中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.110±0.082、0.132±0.095、0.286±0.106，惡性組中β-catenin的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常組和良性組（P<0.001），但正常組與良性組之間無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　　8.卵巢上皮性癌組織中，PITX2蛋白表達(dá)和β-catenin蛋白的異位表達(dá)具有相關(guān)性，

15、并且兩者之間呈正相關(guān)關(guān)系（rp=0.548，P=0.003）。
　　9.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中當(dāng)在SKOV3、OVCAR3細(xì)胞株中分別加入Wnt通路抑制劑DKK130ng/ml時(shí)，細(xì)胞增殖能力和遷移能力均下降（ P<0.05）。
　　10.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中當(dāng)在SKOV3、OVCAR3細(xì)胞株中分別加入Wnt通路抑制劑DKK130ng/ml時(shí)，PITX2、β-catenin mRNA和蛋白質(zhì)均下降（ P<0.05）。
　　結(jié)論
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16、.PITX2和β-catenin在卵巢上皮性癌中異常高表達(dá)，并與卵巢上皮性癌的FIGO分期、組織分化程度以及淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且兩者呈正相關(guān)，說(shuō)明PITX2和β-catenin可能協(xié)同參與了卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展。
　　2.PITX2蛋白在卵巢上皮性癌患者血清中高表達(dá)，提示PITX2可能作為卵巢上皮性癌患者早期診斷、評(píng)估病情進(jìn)展的有效指標(biāo)。
　　3.當(dāng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路受到抑制時(shí)，PITX2表達(dá)量明顯下降