阿德福韋酯致小鼠腎損傷機(jī)制及左卡尼汀的保護(hù)作用研究.pdf

1、目的：
　　目前，臨床上常用的藥物例如抗腫瘤藥、抗癲癇藥、治療腎病藥、免疫抑制劑、抗生素等對腎毒性的研究資料非常豐富，在提高藥物的安全性和療效方面，給臨床提供了很大幫助。臨床資料顯示，阿德福韋酯所致腎損傷的報(bào)道和誤診的報(bào)道逐年增多，但我國對阿德福韋酯所致腎損傷的研究比較少，對其腎毒性的研究更是少見。目前國外有報(bào)道對阿德福韋酯腎毒性發(fā)生的機(jī)制可能和hOAT1和MRP-2這兩種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白密切相關(guān)，血液中阿德福韋通過hOAT1攝取進(jìn)入腎小

2、管上皮細(xì)胞內(nèi)，如果蓄積于細(xì)胞內(nèi)的阿德福韋濃度過大，則通過其自身毒性抑制線粒體DNA的合成，直接造成細(xì)胞毒性，臨床上表現(xiàn)為腎臟近曲小管功能障礙，引起腎毒性。MRP-2可以介導(dǎo)阿德福韋在腎小管細(xì)胞的外排，研究發(fā)現(xiàn)阿德福韋酯致腎損傷的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)MRP-2在腎的表達(dá)下調(diào)。
　　左卡尼汀是一種人體能夠自身產(chǎn)生，并在脂肪代謝過程中起到關(guān)鍵作用的物質(zhì)，它的作用是促進(jìn)脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行氧化分解。左卡尼汀可以將長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)入線粒體內(nèi)，在線粒體

3、酶的作用下，使脂酰CoA進(jìn)行β-氧化同時(shí)產(chǎn)生ATP，而β-氧化過程產(chǎn)生的乙酰基，左卡尼汀可以將其轉(zhuǎn)運(yùn)出線粒體，不但減少了乙?；c游離脂酰CoA結(jié)合，而且提高了線粒體中CoA的水平，進(jìn)而有利于脂肪的進(jìn)一步分解，可以說左卡尼汀是轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸的載體。有學(xué)者認(rèn)為左卡尼汀不但能通過減少溶酶體數(shù)量、減少脂肪沉積等來減輕線粒體損傷，還具有維護(hù)線粒體外形、增加線粒體單位密度的作用，后來有研究者發(fā)現(xiàn)在齊多夫定所引起的線粒體損傷中，當(dāng)使用左卡尼汀后，可以觀察

4、到線粒體損傷明顯減輕，還有報(bào)道稱由于左卡尼汀還是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體中某些酶復(fù)合體的輔助因子，所以其對線粒體結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。臨床上有報(bào)道左卡尼汀對改善慢性病毒性肝炎患者乏力、納差等癥狀有顯著效果，數(shù)據(jù)顯示左卡尼汀治療組患者的總膽固醇水平及血漿ALT較對照組相比明顯降低。研究發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物順鉑不但可以引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡導(dǎo)致腎損傷也可引起腎皮質(zhì)完整線粒體DNA數(shù)量顯著減少，而應(yīng)用左卡尼汀后可以有效減輕順鉑導(dǎo)致的腎組織損傷，顯著降低順鉑引

5、起的caspase-3、8、9活性的升高，保護(hù)腎皮質(zhì)線粒體DNA數(shù)量的減少。
　　本課題旨在探討阿德福韋酯所致腎損傷的腎毒性機(jī)制，我們希望通過建立阿德福韋酯致腎損傷小鼠模型來研究阿德福韋酯對小鼠腎損傷的誘導(dǎo)作用機(jī)制，從可以影響到阿德福韋在腎小管聚集濃度的轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)出這兩方面來發(fā)掘內(nèi)在機(jī)制。因此我們設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)探討了阿德福韋酯對rOAT1和MRP-2表達(dá)水平的影響，以驗(yàn)證其是否為阿德福韋酯腎毒性發(fā)生因素。從腎小管線粒體功能這方面，我們在動

6、物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)上以電鏡觀察阿德福韋酯對線粒體形態(tài)的影響，以檢測細(xì)胞色素C氧化酶和Na+-K+-ATP酶來探討阿德福韋酯對線粒體功能的影響。同時(shí)我們還探討了Kim-1能否作為早期腎損傷指標(biāo)及阿德福韋對HK-2細(xì)胞凋亡的影響。左卡尼汀由于其廣泛的藥理作用，作為腎損傷保護(hù)劑已有較多報(bào)道，但具體到作為阿德福韋酯致腎損傷的保護(hù)劑卻鮮有報(bào)道，本研究希望通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)來證明左卡尼汀作為可以影響能量代謝的藥物是通過何種途徑來保護(hù)阿德福韋酯致腎損傷對抗

7、其腎毒性的，并為左卡尼汀在臨床上的使用提供一定的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.阿德福韋酯致腎損傷動物模型的建立
　　實(shí)驗(yàn)分組:
　　小鼠空白組:等量等滲鹽水灌胃;小鼠阿德福韋酯灌胃組:(40mg/Kg)每周記錄1次各組大鼠飼料消耗、體質(zhì)量變化情況。
　　實(shí)驗(yàn)操作:
　　兩組分別于第0d、7d、14d、21d后小鼠采血后處死取腎組織。HE染色法做病理切片觀察小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)變化，ELISA檢測血清KI

8、M-1的變化，由自動生化分析儀進(jìn)行檢測SCr、BUN水平。
　　2.左卡尼汀對阿德福韋酯致腎損傷小鼠保護(hù)作用的研究
　　實(shí)驗(yàn)分組:
　　小鼠空白組:等量等滲鹽水灌胃;小鼠阿德福韋酯灌胃組:（40mg/Kg）每周記錄1次各組大鼠飼料消耗、體質(zhì)量變化情況;阿德福韋酯+左卡尼?。?.5g/Kg）組:同時(shí)灌胃阿德福韋酯和左卡尼汀。
　　實(shí)驗(yàn)操作:
　　各組分別于第21d采血后處死取腎組織，ELISA檢測血清KIM-

9、1水平，透射電鏡觀察各組腎小管上皮細(xì)胞線粒體超微病理結(jié)構(gòu)的改變情況，以試劑盒上的標(biāo)準(zhǔn)步驟檢測細(xì)胞色素c氧化酶活性、Na+-K+-ATPase活性、western blot法檢測陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(rOAT1)和MRP-2表達(dá)情況。
　　3.阿德福韋酯致腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞損傷及左卡尼汀的保護(hù)機(jī)制研究
　　實(shí)驗(yàn)分組:
　　空白組:不加任何藥物;腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)與阿德福韋酯作用組:只加入阿德福韋酯，濃度梯度為

10、10、20、40、80、160、320（μmol/L）作用時(shí)間為24h;阿德福韋酯+左卡尼?。?8.5μmol/L）組:在阿德福韋酯作用組的基礎(chǔ)上加入左卡尼汀(48.5μmol/L)。
　　實(shí)驗(yàn)操作:
　　MTT法檢測阿德福韋酯對腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞增殖的影響;透射電鏡觀察細(xì)胞線粒體的形態(tài);嚴(yán)格按照試劑盒步驟檢測細(xì)胞色素c氧化酶的活性、Na+-K+-ATPase的活性;流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況、以western

11、 bolt法檢測陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(hOAT1)、MRP-2的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.阿德福韋酯灌胃21d后成功建立阿德福韋酯致腎損傷小鼠模型，HE染色法觀察病理切片可以看到腎小管發(fā)生損傷為研究阿德福韋酯腎毒性打下基礎(chǔ)
　　2.阿德福韋酯腎損傷模型小鼠的血液SCr、BUN水平同正常對照組相比沒有發(fā)生明顯變化，而血清Kim-1的水平明顯上升。
　　3.ELISA檢測Kim-1結(jié)果顯示，在小鼠中阿德福韋酯聯(lián)合左

12、卡尼汀組同阿德福韋酯單用組相比，血清Kim-1水平顯著降低;而聯(lián)合組同正常對照組相比，血清Kim-1水平?jīng)]有顯著差異。透射電鏡觀察到阿德福韋酯聯(lián)合左卡尼汀組腎小管上皮細(xì)胞的線粒體呈現(xiàn)中度損傷;阿德福韋酯單用組呈現(xiàn)為重度損傷。
　　4.試劑盒檢測細(xì)胞色素c氧化酶、Na+-K+-ATPase的活性的結(jié)果顯示在小鼠中阿德福韋酯單用組均顯著低于正常組和聯(lián)合左卡尼汀組;聯(lián)合左卡尼汀組同樣顯著低于正常對照組。
　　5.Western b

13、lot結(jié)果顯示阿德福韋酯單用組同聯(lián)合左卡尼汀組和對照組相比小鼠腎細(xì)胞的rOAT1的表達(dá)顯著降低，MRP-2的表達(dá)顯著增高;聯(lián)合左卡尼汀組同正常對照組相比，rOAT1的表達(dá)顯著降低，MRP-2的表達(dá)顯著增高。
　　6.MTT結(jié)果顯示阿德福韋酯對腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞增殖抑制的影響呈劑量依賴性，藥物濃度越大，細(xì)胞增殖活力越低。但聯(lián)合左卡尼汀組的細(xì)胞增殖活力要顯著高于阿德福韋酯單用組，并且在40-80μmol/L時(shí)差異最為顯著。

14、r>　　7.在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞色素C氧化酶、Na+-K+-ATPase的活性檢測和透射電鏡結(jié)果同小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)一致，即阿德福韋酯單用組均顯著低于正常組和聯(lián)合左卡尼汀組，聯(lián)合左卡尼汀組同樣顯著低于正常對照組;阿德福韋酯聯(lián)合左卡尼汀組腎小管上皮細(xì)胞的線粒體呈現(xiàn)中度損傷;阿德福韋酯單用組呈現(xiàn)為重度損傷。
　　8.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果證明阿德福韋酯可以使HK-2細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且阿德福韋對HK-2細(xì)胞凋亡率的影響呈劑量依賴性，劑量越大，凋亡

15、率越高;當(dāng)聯(lián)合使用左卡尼汀時(shí)可顯著降低阿德福韋酯所致凋亡的發(fā)生，并且在阿德福韋的劑量越大時(shí)，左卡尼汀的這種保護(hù)作用越明顯。
　　9.Western blot結(jié)果顯示阿德福韋單用組隨著濃度的增加，HK-2細(xì)胞中hOAT1的表達(dá)不斷升高，而聯(lián)合左卡尼汀組hOAT1的表達(dá)在阿德福韋酯各個(gè)濃度點(diǎn)均低于單用組，但其表達(dá)量的變化趨勢是一致的;MRP-2的表達(dá)隨著阿德福韋酯濃度的增加而不斷降低，聯(lián)合左卡尼汀組在各個(gè)阿德福韋酯濃度點(diǎn)要顯著高于單用

16、組，兩組MRP-2隨著阿德福韋酯濃度的增加，其表達(dá)量的變化趨勢是一致的，均為不斷降低。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立阿德福韋酯致小鼠腎損傷模型，明確了在阿德福韋酯作用21d為腎損傷造模成功的時(shí)間點(diǎn)。
　　2.血液SCr、BUN水平由于對腎損傷不敏感不能作為腎損傷檢測指標(biāo)，而血清Kim-1水平的變化可以作為早期腎損傷的檢測指標(biāo)。
　　3.阿德福韋酯通過直接作用于腎小管上皮細(xì)胞通過影響細(xì)胞色素C氧化酶、Na+-K+-

17、ATPase的活性進(jìn)而影響腎小管上皮細(xì)胞線粒體的形態(tài)和功能，對其功能產(chǎn)生阻礙，進(jìn)而影響到形態(tài)發(fā)生異常直至凋亡。
　　4.阿德福韋酯的腎毒性和hOAT1、MRP-2的表達(dá)相關(guān)，阿德福韋酯可以促使腎小管上皮細(xì)胞高表達(dá)hOAT1、低表達(dá)MRP-2，進(jìn)一步促進(jìn)了阿德福韋酯在腎小管部位的蓄積而產(chǎn)生毒性作用，嚴(yán)重者可加快腎小管細(xì)胞的凋亡。
　　5.阿德福韋酯可以促使腎小管細(xì)胞發(fā)生凋亡，濃度越高，凋亡率越高。
　　6.左卡尼汀可有效