基于多種載體的新型固定化蛋白酶的制備和在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用.pdf

1、近年來,由于發(fā)現(xiàn)和驗證生物標(biāo)志物、重要功能蛋白質(zhì)及藥物靶標(biāo)越來越受到人們的關(guān)注,從而使得作為全面分析蛋白質(zhì)表達(dá)變化的有力工具蛋白質(zhì)組學(xué)被廣泛應(yīng)用到多種疾病的研究中。作為目前蛋白質(zhì)組研究中應(yīng)用最為廣泛的研究策略,“鳥槍法”策略是通過對蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物肽段進行分析從而獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)定性、定量信息。因此,高效、完全的蛋白質(zhì)酶解便成為該策略中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。與傳統(tǒng)溶液酶解方式相比,固定化酶解可顯著降低酶解所需時間,提高樣本處理通量,因此在近年來受

2、到廣泛重視。
　　本研究采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法制備了多種基于聚合物修飾微米、納米載體的新型固定化酶試劑,實現(xiàn)了胰蛋白酶的高密度、高負(fù)載量固定。同時,線性聚合物鏈可作為三維支架結(jié)構(gòu),支撐多層蛋白酶固定,提高了酶與蛋白質(zhì)底物的碰撞幾率,從而顯著提高了酶解效率和完全性。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)牛血清白蛋白為樣本,使用所制備的固定化酶試劑,1min后即可完成酶解,使用質(zhì)譜鑒定到肽段的氨基酸序列覆蓋率超過90％,明顯高于溶液酶解或文獻(xiàn)報道現(xiàn)有固定化酶

3、試劑的酶解效率。使用酵母菌或騰沖嗜熱菌全蛋白提取物為樣本,進一步對所使用的微米、納米,以及具有不同表面性的載體材料進行考察發(fā)現(xiàn),載體材料的尺度和表面親疏水性對固定化酶的酶解效率以及底物選擇性具有一定影響。所制備固定化酶試劑1-3min的酶解產(chǎn)物鑒定到蛋白質(zhì)數(shù)量均超過同樣條件下溶液酶解12h的結(jié)果。但使用納米材料制備的固定化酶試劑,酶解效率明顯高于微米載體材料。同時,磁性納米顆粒相對具有比表面積大,酶負(fù)載量多及磁性納米顆粒通過磁性相對易于