基于AGEs-RAGE加味桃核承氣湯防治T2DM大血管病變大鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、文獻(xiàn)研究:
　　隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、環(huán)境的改變、人們工作節(jié)奏的加快、生活方式的改變以及人口老齡化的加速，糖尿病(diabetes mellitus，DM)已成為影響人類健康最重要的慢性非傳染性疾病。在眾多DM并發(fā)癥中，DM大血管病變，包括冠狀動(dòng)脈、腦動(dòng)脈、下肢動(dòng)脈病變，是DM最主要的致死致殘并發(fā)癥。研究指出，DM患者患上大血管病變的風(fēng)險(xiǎn)比非DM患者增加2-4倍，75％的DM患者最終死于DM大血管病變誘發(fā)的心腦血管事件。動(dòng)脈粥樣硬化(a

2、therosclerosis，AS)是DM大血管病變的主要病理表現(xiàn)，早期發(fā)現(xiàn)AS，并使用相應(yīng)藥物進(jìn)行干預(yù)，對(duì)延緩AS進(jìn)展、改善患者預(yù)后、降低心腦血管終點(diǎn)事件十分重要。然而，目前西醫(yī)學(xué)對(duì)于早期篩查AS尚缺乏敏感性和特異性高的檢驗(yàn)學(xué)指標(biāo)，在藥物治療方面亦存在消化道出血、橫紋肌溶解等副作用，因此亟需尋找一種更安全、更高效的藥物以用于臨床。
　　目前認(rèn)為晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycationend products，AG

3、Es)的過(guò)多生成，AGEs-RAGE途徑的激活是DM大血管病變的重要發(fā)病機(jī)制，許多實(shí)驗(yàn)與臨床研究證實(shí)AGEs水平與DM大血管病變具有顯著相關(guān)性，但目前仍缺乏相應(yīng)的循證證據(jù)支持。
　　中醫(yī)學(xué)雖無(wú)DM大血管病變之統(tǒng)稱，但可散見(jiàn)于“胸痹”、“真心痛”、“眩暈”、“暈厥”、“中風(fēng)”、“癡呆”、“偏枯”、“痹癥”、“脫疽”、“痰飲”、“瘀血”“厥證”等病名，古今醫(yī)家數(shù)千年以來(lái)對(duì)治療此類疾病積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。熊曼琪教授是廣州中醫(yī)藥大學(xué)首席教授

4、，基于消渴病“氣陰兩虛，瘀熱互結(jié)”的病機(jī)，熊教授在《傷寒論》桃核承氣湯基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出加味桃核承氣湯以用于臨床，并取得良好療效。前期研究已發(fā)現(xiàn)，加味桃核承氣湯具有降糖、調(diào)脂、改善胰島素抵抗、保護(hù)胰島β細(xì)胞，改善眾多DM并發(fā)癥的作用。朱章志教授認(rèn)為，DM大血管病變臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變，其背后的病機(jī)隨著疾病的進(jìn)展而變化，大多數(shù)患者病機(jī)還具有“少陰陽(yáng)虛”、“陽(yáng)失健運(yùn)”的特點(diǎn)，并據(jù)此對(duì)熊教授原創(chuàng)加味桃核承氣湯作出了相應(yīng)的配伍加減。為進(jìn)一步研究各組方對(duì)防

5、治DM大血管病變的可能機(jī)制，優(yōu)化加味桃核承氣湯的組方配伍，本研究以AGEs-RAGE途徑、氧化應(yīng)激為研究切入點(diǎn)，借助動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用多種現(xiàn)代科學(xué)手段加以評(píng)估，以期進(jìn)一步發(fā)掘加味桃核承氣湯的臨床效能。
　　循證研究:
　　目的:
　　AGEs的生成過(guò)多，AGEs-RAGE途徑的激活是DM大血管病變的重要發(fā)病機(jī)制，已有多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)DM大血管病變患者的血清AGEs水平與單純DM患者（指未發(fā)現(xiàn)DM并發(fā)癥的患者）、健康人群相比存在

6、顯著差異，但至今尚未有循證醫(yī)學(xué)上的證據(jù)。因此，本研究擬采用Meta分析的方法，根據(jù)初定的納入排除標(biāo)準(zhǔn)，檢索國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，并對(duì)納入文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行合并分析，以探討AGEs與DM大血管病變的相關(guān)性，從而為AGEs未來(lái)的臨床應(yīng)用提供一定的循證支持。
　　方法:
　　根據(jù)初定的納入排除標(biāo)準(zhǔn)，以“晚期糖基化終末產(chǎn)物”、“糖尿病大血管病變”、“冠心病”、“腦卒中”、“糖尿病足”、“下肢動(dòng)脈病變”、“動(dòng)脈粥樣硬化”、“AGEs”、、“co

7、ronary heart disease”、“diabetic macroangiopathy”、“atherosclerosis”、“diabetic foot”、“cerebral apoplexy”檢索國(guó)內(nèi)外數(shù)據(jù)庫(kù)關(guān)于AGEs與DM大血管病變、單純DM患者以及健康人群的文獻(xiàn)，篩選出要納入的文獻(xiàn)后，從中提取文獻(xiàn)的一般特征及相關(guān)納入指標(biāo)，并使用RevMan5.3統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)納入指標(biāo)進(jìn)行Meta分析。最后根據(jù)Meta分析的結(jié)果對(duì)AGEs與

8、DM大血管病變的相關(guān)性進(jìn)行分析推理，對(duì)其中存在異質(zhì)性的部分使用敏感性分析等手段處理，并借助漏斗圖對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行發(fā)表偏倚評(píng)估。
　　結(jié)果:
　　共納入14個(gè)研究，1290例患者，其中DM大血管病變患者338例，單純DM患者607例，健康人群345例，Meta分析結(jié)果表明，AGEs-CML方面，DM大血管病變患者較單純DM患者、健康人群顯著升高（P＜0.01），且經(jīng)過(guò)敏感性分析后結(jié)果穩(wěn)定;AGEs方面，DM大血管病變患者較健康人群顯

9、著升高（P＜0.01），DM大血管病變患者經(jīng)敏感性分析后較單純DM患者顯著升高（P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　以AGEs-CML為代表，DM大血管病變患者血清AGEs-CML水平較單純DM患者、健康人的存在顯著差異，其機(jī)制可能為DM大血管病變患者AGEs生成過(guò)多，激活A(yù)GE-RAGE途徑，引起下游一系列通路的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，從而破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞，影響血管內(nèi)皮功能，促進(jìn)AS的進(jìn)展，最終發(fā)展為DM大血管病變。本次Meta

10、分析從循證醫(yī)學(xué)角度印證了AGEs在DM大血管病變中具有一定的特異性升高，但受研究質(zhì)量、異質(zhì)性的影響，AGEs要成為一種特異性、敏感性指標(biāo)用于DM大血管病變?cè)\斷、評(píng)估仍有待進(jìn)一步大樣本、高質(zhì)量、多中心的臨床研究、實(shí)驗(yàn)研究加以證實(shí)。
　　實(shí)驗(yàn)研究:
　　目的:
　　立足朱章志教授對(duì)DM大血管病變的診療經(jīng)驗(yàn)，對(duì)熊曼琪教授原創(chuàng)加味桃核承氣湯進(jìn)行配伍加減，進(jìn)一步加減變化為中藥2組（原創(chuàng)方改生大黃為熟大黃，倍芒硝）、中藥3組（原創(chuàng)

11、方入細(xì)辛，倍桂枝）?；贏GEs-RAGE途徑及其下游的氧化應(yīng)激通路，通過(guò)與中藥1組（原創(chuàng)方）、西藥組（氨基胍）作對(duì)比，借助動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、HE染色、QRT-PCR、IHC、電子顯微鏡、Western blotting、ELISA等現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段，以探討加味桃核承氣湯防治T2DM大血管病變的可能作用機(jī)制，以期發(fā)掘加味桃核承氣湯防治T2DM大血管病變的更優(yōu)配伍組方及作用潛能，從而為臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　方法:
　　120只

12、雄性SD大鼠經(jīng)普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)抽出10只大鼠作為正常組，該組繼續(xù)使用普通飼料喂養(yǎng)，余下110只大鼠作為造模組改用高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周。6周后進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，預(yù)實(shí)驗(yàn)后確定STZ40mg/kg為造模劑量，隔日對(duì)剩余89只大鼠按40 mg/kg的劑量腹腔注射STZ造模，正常組則腹腔注射等量檸檬酸緩沖液，兩次FPG穩(wěn)定在11.1mmol/L以上確立為T2DM成模大鼠，最后共成模74只。將成模大鼠按FPG水平分層，然后按分

13、層情況進(jìn)一步隨機(jī)分為5組，其中模型組14只，中藥1組15只、中藥2組15只、中藥3組15只，西藥組15只。實(shí)施藥物干預(yù)共8周。實(shí)驗(yàn)期間觀察大鼠的一般情況，每隔4周測(cè)大鼠體重、攝食量、攝水量及尾尖FPG，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)使用ELISA法檢測(cè)FINS，計(jì)算Homa-IR;全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)HbA1c、TC、TG、HDL-C、LDL-C、SOD、CAT、GSH-Px等血糖血脂、氧化應(yīng)激指標(biāo);ELISA法測(cè)胸主動(dòng)脈AGEs的含量，光鏡、電鏡觀察胸主

14、動(dòng)脈病理形態(tài)，IHC法觀察胸主動(dòng)脈AGEs的染色情況，Western blotting法檢測(cè)各組大鼠胸主動(dòng)脈ERK1/2蛋白的表達(dá)、RTQ-PCR法檢測(cè)各組大鼠胸主動(dòng)脈RAGE mRNA、eNOS mRNA、p47phox mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、一般情況:正常組在實(shí)驗(yàn)全過(guò)程保持精神狀況良好，皮膚嫩滑，毛色光亮，體重平穩(wěn)上升，尿量、糞便量正常，無(wú)多飲、多食。模型組大鼠則出現(xiàn)明顯多飲、多食、多尿、消瘦等癥狀，精神

15、差，反應(yīng)緩慢，毛發(fā)干枯，皮膚干燥，糞便量偏少偏硬。藥物干預(yù)后，各藥物干預(yù)組大鼠的精神情況、體征、體重、口干多飲等癥狀較模型組都得到不同程度的改善，但仍較正常組差。最終大鼠共死亡11只，其中模型組死亡4只，中藥1組死亡3只，中藥2組死亡2只，中藥3組死亡1只，西藥組死亡1只。死亡原因主要考慮糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病高滲性昏迷、灌胃失誤導(dǎo)致肺部感染等急性并發(fā)癥。實(shí)驗(yàn)結(jié)束共71只大鼠完成實(shí)驗(yàn)，其中正常組10只，模型組10只，中藥1組11只，中

16、藥2組12只，中藥3組14只，西藥組14只。體重、攝水量、攝食量方面，正常組體重隨著時(shí)間遷移平穩(wěn)增加，攝水量、攝食量則無(wú)明顯變化;模型組體重則逐漸下降，攝水量、攝食量逐步增加;分析時(shí)間因素、干預(yù)因素、時(shí)間因素與干預(yù)因素的交互作用，各藥物干預(yù)組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;藥物干預(yù)8周后，各藥物干預(yù)組在增加體重、降低攝水量、降低攝食量方面均顯著優(yōu)于模型組（P＜0.01），但較正常組仍較差（P＜0.01），其中中藥3組在增加體重、降

17、低攝水量方面顯著優(yōu)于其余藥物干預(yù)組（P＜0.01），在攝食量改善方面與其他藥物干預(yù)組相當(dāng)（P＞0.05），中藥1組、中藥2組在減少攝水量方面顯著優(yōu)于西藥組(P＜0.01)。
　　2、糖脂代謝及胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，藥物干預(yù)8周后，各藥物干預(yù)組在FPG、HbA1c方面均顯著低于模型組(P＜0.01)，但仍顯著高于正常組（P＜0.01)，中藥1組、中藥2組、西藥組較中藥3組顯著升高（P＜0.01）。

18、脂代謝方面，藥物干預(yù)8周后，各中藥干預(yù)組在TC、TG、LDL-C、HDL-C均無(wú)組間差異;TC、TG、LDL-C方面，各中藥干預(yù)組較模型組TC顯著降低（P＜0.01），西藥組較模型組則無(wú)明顯差異（P＞0.05）;HDL-C方面，各中藥干預(yù)組較模型組顯著升高（P＜0.01），西藥組較模型組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。IR方面，各藥物干預(yù)組均較模型組顯著降低（P＜0.01），較正常組顯著增加(P＜0.01)，各藥物干預(yù)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

19、P＞0.05）。
　　3、AGEs-RAGE途徑，各造模組在藥物干預(yù)8周后AGEs濃度較正常組顯著增多(P＜0.01)，其中模型組增幅最多（P＜0.01），中藥1組較中藥2組無(wú)明顯差別(P＞0.05)，西藥組、中藥3組較中藥1組、中藥2組顯著減少（P＜0.01），中藥3組較西藥組無(wú)明顯差異（P＞0.05），免疫組化IOD值方面與胸主動(dòng)脈AGEs ELISA檢測(cè)含量結(jié)果變化一致，圖像顯示，AGEs在各組大鼠胸主動(dòng)脈中呈棕黃色顆粒沉淀

20、，其中，正常組可見(jiàn)散在稀疏棕黃色顆粒沉淀，染色較淺;模型組則在內(nèi)皮層、平滑肌層、血管壁間質(zhì)均可見(jiàn)大量棕黃色顆粒沉淀，染色極深;各藥物干預(yù)組棕黃色沉淀染色較模型組淺，但較正常組深;中藥3組、西藥組較中藥1組、中藥2組、染色淺，其中中藥3組棕黃色顆粒主要沉淀在內(nèi)皮層，平滑肌層僅見(jiàn)稀疏、淺染棕黃色顆粒;中藥1組、中藥2組、西藥組內(nèi)皮層、平滑肌層均可見(jiàn)深染棕黃色顆粒沉淀，其中中藥1組、中藥2組較西藥組棕黃色顆粒沉淀增多。RAGE mRNA方面，

21、各藥物干預(yù)組較模型組顯著減少（P＜0.01），中藥1組較中藥2組無(wú)明顯差別（P＞0.05），西藥組較中藥1組顯著減少(P＜0.01)，中藥2組、中藥3組較西藥組無(wú)明顯差別（P＞0.05）。
　　4、氧化應(yīng)激:各組在SOD、CAT、GSH-Px中的變化趨勢(shì)，組間比較大致相同。正常組較各造模組顯著升高（P＜0.01），各藥物干預(yù)組較模型組顯著升高（P＜0.01），中藥3組較中藥1組、中藥2組、西藥組顯著升高（P＜0.01），中藥1組、

22、中藥2組較西藥組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。p47phox mRNA方面，各造模組在干預(yù)8周后仍較正常組顯著升高（P＜0.01），中藥1組較模型組降低（P＜0.05），中藥2組、中藥3組、西藥組較模型組顯著降低（P＜0.01），中藥3組較中藥1組、中藥2組、西藥組顯著降低（P＜0.01）。
　　5、內(nèi)皮功能:在eNOS mRNA表達(dá)上，正常組較各造模組顯著升高（P＜0.01），模型組較各藥物干預(yù)組顯著降低（P＜0.01），中藥3組

23、較中藥1組、中藥2組、西藥組顯著升高（P＜0.01），中藥1組、中藥2組較西藥組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。在ERK1、ERK2表達(dá)上，各組組間比較及變化趨勢(shì)相近，western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，正常組較各造模組顯著降低(P(0.01)，各藥物干預(yù)組較模型組顯著降低(P＜0.01)，中藥1組、中藥2組、中藥3組較西藥組顯著降低(P＜0.01)，中藥1組、中藥2組較中藥3組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　6、胸主動(dòng)脈

24、病理形態(tài):HE染色方面，正常組顯示內(nèi)皮層各細(xì)胞鏈接緊密，無(wú)脫落，無(wú)腫脹變性，無(wú)泡沫細(xì)胞形成，平滑肌層亦鏈接緊密，無(wú)異常增殖。模型組顯示內(nèi)皮層細(xì)胞脫落嚴(yán)重，細(xì)胞腫脹明顯，可見(jiàn)泡沫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，平滑肌層結(jié)構(gòu)紊亂，平滑肌細(xì)胞明顯增殖，在內(nèi)皮層可見(jiàn)纖維帽形成;中藥1組、中藥2組、中藥3組、西藥組病變情況較模型組減輕;中藥1組顯示內(nèi)皮細(xì)胞脫落、腫脹，內(nèi)皮層可見(jiàn)少量脂質(zhì)沉積，少量泡沫細(xì)胞形成，平滑肌層細(xì)胞鏈接紊亂，可見(jiàn)細(xì)胞異常增殖，但未見(jiàn)纖維帽形

25、成;中藥2組顯示內(nèi)皮細(xì)胞稍腫脹，病變程度較中藥1組稍減輕，未見(jiàn)明顯泡沫細(xì)胞、纖維帽形成，平滑肌層可見(jiàn)細(xì)胞異常增殖，細(xì)胞鏈接不規(guī)律;中藥3組顯示內(nèi)皮層細(xì)胞輕微腫脹，但各細(xì)胞間鏈接尚密切，未見(jiàn)明顯泡沫細(xì)胞、纖維帽形成，病變程度較中藥1組、中藥2組、西藥組減輕，平滑肌層亦未見(jiàn)明顯異常增殖;西藥組顯示內(nèi)皮層細(xì)胞稍腫脹，可見(jiàn)少量泡沫細(xì)胞形成，未見(jiàn)纖維帽形成，平滑肌細(xì)胞排列紊亂、松散。電鏡結(jié)果顯示，正常組胸主動(dòng)脈各內(nèi)皮細(xì)胞鏈接緊密，內(nèi)皮細(xì)胞緊貼內(nèi)皮

26、下層，細(xì)胞膜完整光滑，細(xì)胞內(nèi)各結(jié)構(gòu)正常;模型組內(nèi)皮細(xì)胞壞死并脫落，呈空泡樣，細(xì)胞內(nèi)各結(jié)構(gòu)消失溶解;中藥1組顯示內(nèi)皮細(xì)胞變性損傷，細(xì)胞膜破壞，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)模糊，并與內(nèi)皮下層形成間隙;中藥2組顯示內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜損傷，但仍能清楚看到細(xì)胞核;中藥3組顯示內(nèi)皮細(xì)胞水腫、損傷，損傷程度較中藥1組、中藥2組、西藥組輕，細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器尚清晰;西藥組顯示內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜變性損傷較嚴(yán)重，細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器不清晰，但較模型組損傷程度輕。
　　結(jié)論:
　　

27、在改善一般情況方面，加味桃核承氣湯能夠有效降低減少T2DM大血管病變大鼠攝水量、攝食量，并有效增加大鼠體重;血糖方面，加味桃核承氣湯能夠通過(guò)改善胰島素抵抗、降低FPG、HbA1c起到平穩(wěn)降糖的效果;血脂方面，加味桃核承氣湯能通過(guò)降低TG、TC、LDL-C，升高HDL-C起到改善脂質(zhì)代謝的效果;在保護(hù)大血管病變方面，加味桃核承氣湯能夠通過(guò)AGEs-RAGE途徑，降低AGEs生成，降低受體RAGE mRNA的表達(dá)，從而抑制AGEs-RAGE

28、系統(tǒng)，并通過(guò)增加血清SOD、CAT、GSH-Px水平，降低p47phox mRNA表達(dá)，修復(fù)機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力，最后通過(guò)增加eNOS mRNA，減少ERK1/2蛋白表達(dá)，起到改善內(nèi)皮功能、減少血管平滑肌細(xì)胞異常增殖、延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的效果。此外，本次實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)西藥氨基胍雖能有效降低AGEs生成，但其延緩AS的作用較弱，說(shuō)明DM大血管病變的機(jī)制仍然是多靶點(diǎn)的，今后仍需要大樣本、多中心的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí)。另一方面，組間比較結(jié)果顯示，中

29、藥3組相較于中藥1組、中藥2組、西藥組能夠更有效抑制AGEs-RAGE通路、修復(fù)抗氧化應(yīng)激能力、更有效地延緩AS的進(jìn)展，究其深入的中醫(yī)學(xué)理論，中藥3組較其余兩組主要加強(qiáng)了“溫運(yùn)陽(yáng)氣”的作用，體現(xiàn)了DM大血管病變的病機(jī)除氣陰不足、瘀熱互結(jié)外，還具有陽(yáng)失健運(yùn)的特點(diǎn)，這提示了今后中醫(yī)藥在治療DM大血管病變過(guò)程中除注重既往的益氣養(yǎng)陰、活血化瘀外，還應(yīng)重視“溫運(yùn)陽(yáng)氣”，這為中醫(yī)藥防治DM大血管病變奠定了重要的理論基礎(chǔ)，有待今后臨床與實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步