MicroRNA-149在左心疾病相關(guān)肺高壓形成中的作用及預(yù)測價(jià)值.pdf

1、目的：
　　通過建立大鼠主動(dòng)脈弓縮窄（transverse aortic constriction，TAC）模型，觀察左心負(fù)荷增高對(duì)肺血流動(dòng)力學(xué)及肺血管重構(gòu)的影響;利用芯片篩選出TAC大鼠模型肺組織表達(dá)變化的microRNA譜，分析其調(diào)控的靶基因與信號(hào)通路，并在組織和循環(huán)水平上進(jìn)行驗(yàn)證，分析循環(huán)microRNA變化與血流動(dòng)力學(xué)的相關(guān)性;通過臨床病例驗(yàn)證，進(jìn)一步探索microRNA對(duì)PH-LHD的預(yù)測意義。
　　方法：

2、　　第一部分：
　　1.建模：40只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為Sham組(n=20)和TAC組(n=20)，TAC組在主動(dòng)脈弓處以16G針頭墊扎，形成主動(dòng)脈弓縮窄;Sham組不結(jié)扎主動(dòng)脈弓。
　　2.檢測指標(biāo)：1）一般情況;2）心臟超聲檢測大鼠心臟重構(gòu)和功能;3）心導(dǎo)管檢查明確血流動(dòng)力學(xué)變化;4）病理學(xué)觀察肺血管重構(gòu)。
　　第二部分：
　　1.利用microRNA芯片檢測TAC和Sham大鼠肺組織樣本，篩選micr

3、oRNA的差異表達(dá)譜，并使用miR-Path v.3預(yù)測經(jīng)過聚類的兩組差異microRNA靶基因，得到靶基因的富集結(jié)果，預(yù)測PH-LHD相關(guān)信號(hào)通路。
　　2.采用基于SYBR Green熒光染料的方法對(duì)肺組織差異表達(dá)的microRNA行實(shí)時(shí)定量PCR檢測驗(yàn)證;進(jìn)一步檢測大鼠血清microRNA水平，并統(tǒng)計(jì)分析其與大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性。
　　第三部分：
　　1.根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)選取于2014年6月至2016年11

4、月在第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科就診患者，以PASP≥50mmHg作為診斷PH的依據(jù)，收集PH-LHD患者34例、單純LHD46例。采集受試者的基本資料與臨床數(shù)據(jù)：年齡、性別、身高、體重、吸煙史、體重指數(shù)、血壓、心率、紐約心功能分級(jí)、心臟超聲檢測數(shù)據(jù)、BNP。采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測所有受試者血清中microRNA水平，分析其與臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性。
　　2.使用SPSS軟件（版本20.0，IBM公司，美國）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用中

5、位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和百分比表示;組間資料的差異采用Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析;采用Spearman相關(guān)系數(shù)評(píng)估m(xù)iR-149水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性;采用logistic回歸進(jìn)行單因素、多因素分析，并計(jì)算得到比值比、95％可信區(qū)間;采用ROC曲線進(jìn)行預(yù)測價(jià)值分析，并計(jì)算到曲線下面積、敏感度、特異度。
　　結(jié)果：
　　第一部分：
　　1.手術(shù)過程中因麻醉意外、氣胸、主動(dòng)脈破裂原因?qū)е?/p>

6、TAC組3只死亡，Sham組9只死亡;在8周的飼養(yǎng)過程中，觀察到與Sham組相比，TAC組模型體重減輕，四肢及胸前區(qū)出現(xiàn)青紫，精神狀態(tài)欠佳，共計(jì)7只在飼養(yǎng)過程中死亡;最后得到10只TAC模型，11只Sham模型。進(jìn)一步稱重測量表明，與Sham組相比，TAC組右心肥厚指數(shù)(RVHI)升高(23.46±0.77％vs27.40±2.68％;P=0.010)。
　　2.模型建立8周時(shí)，心臟超聲檢查提示，與Sham組(n=11)相比，TA

7、C組(n=10)肺動(dòng)脈直徑增大：2.61(2.50，3.31)mm vs2.97(2.75，3.25)mm(P＜0.05);左室射血分?jǐn)?shù)降低：84.99(79.53，88.46)％vs69.75(56.57，82.61)％(P＜0.05);左室心肌質(zhì)量增加：573.27(465.68，677.54)mg vs680.77(588.27，836.55)mg(P＜0.05);舒張期左室體積增大：160.40(125.04,187.51)ul

8、 vs201.86(162.47,217.21)ul(P＜0.05)。
　　3.模型建立8周時(shí)，右心導(dǎo)管檢查發(fā)現(xiàn)，與Sham組(n=11)相比，TAC組(n=10)mean pulmonary arterial pressure(mPAP)升高(16.22±2.23mmHg vs22.13±2.74mmHg;P＜0.001)，其中90％的模型大鼠mPAP介于19-24mmHg之間，屬于臨界PH;1只模型大鼠mPAP達(dá)到28.64m

9、mHg，形成PH。同時(shí)LVSP(140.04±28.01mmHg vs172.22±29.17mmHg;P＜0.001)、RVSP(26.66±2.74mmHg vs29.12±2.08mmHg;P=0.031)升高，LV Max(dp/dt)(12278.66±1309.28m mHg/s vs9124.76±838.36mmHg/s;P＜0.001)、RV Max(dp/dt)(1892.47±272.69mmHg/s vs1491

10、.78±261.20mmHg/s;P=0.003)降低。
　　第二部分：
　　1.以Sham組大鼠肺組織為對(duì)照，經(jīng)microRNA芯片分析，一共對(duì)385個(gè)microRNA進(jìn)行檢測分析，篩選出TAC組水平差異大于1.5倍且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的microRNA，差異基因經(jīng)過聚類分析排除個(gè)體差異，發(fā)現(xiàn)較Sham組，TAC組上調(diào)的有rno-miR-143-3p、rno-miR-181a-5p、rno-miR-125b-1-3p，下調(diào)的有

11、rno-miR-206-3p、rno-let-7b-5p、rno-miR-200b-3p、rno-miR-21-5p、rno-let-7b-5p、rno-miR-149-3p，進(jìn)一步KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)差異變化的microRNA靶基因（其中包括Tnf、Chrd、Smad2、Smad7、Acvr1c、Acvr2a、Rps6kb1、Smurf2、Bmp5、Tgfbr1）的功能集中于TGF-β信號(hào)通路。
　　2.進(jìn)一步驗(yàn)證大鼠肺組織

12、miR-149水平，發(fā)現(xiàn)TAC組miR-149水平下調(diào)，RQ值分別為（1.141±0.201vs0.300±0.028;P＜0.001）。檢測TAC大鼠血清miR-149水平，發(fā)現(xiàn)變化趨勢與肺組織一致，相對(duì)定量(RQ)值分別為(1.018±0.060vs0.467±0.047;P＜0.001);統(tǒng)計(jì)分析循環(huán)miR-149水平與大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)相關(guān)性分析，循環(huán)miR-149水平與mPAP(r=-0.752，P＜0.001)、RVHI(r

13、=-0.643，P=0.002)呈負(fù)相關(guān)，與LVSP(r=0.739，P＜0.001)、RVMax(dp/dt)(r=0.534,P=0.013)、LVMax(dp/dt)(r=0.728,P＜0.001)呈正相關(guān)，與RVSP(r=-0.309，P=0.173)統(tǒng)計(jì)學(xué)上無相關(guān)性。
　　第三部分：
　　1.檢測受試者循環(huán)miR-149水平，發(fā)現(xiàn)LHD對(duì)照組以及PH-LHD組RQ值分別為1.00(0.73，1.81)vs0.58

14、(0.49，1.08)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)析PH-LHD組miR-149的表達(dá)顯著低于LHD組(P=0.002)。采用Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)受試者循環(huán)miR-149與PASP(r=-0.286，P=0.010)、左心室舒張末期內(nèi)徑（r=-0.345，P=0.002）、BNP(r=-0.306，P=0.006)、紐約心功能分級(jí)(r=-0.232，P=0.038)呈負(fù)相關(guān);與LVEF呈正相關(guān)(r=0.247，P=0.027)。
　　2.

15、通過logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，循環(huán)miR-149降低，PASP≥50mmHg發(fā)生的可能性增高。應(yīng)用ROC曲線評(píng)估m(xù)iR-149對(duì)PASP≥50mmHg發(fā)生的預(yù)測價(jià)值：AUC=0.699，95％CI：0.579～0.820(P=0.002)，其最佳閾值為0.52，敏感度為0.500，特異度為0.891。采用二元Logistic正向逐步回歸篩選出預(yù)測PASP≥50mmHg的聯(lián)合標(biāo)志物為左心房舒張末期內(nèi)徑、循環(huán)miR-149和BNP并獲得

16、其預(yù)測模型，ROC分析表明預(yù)測模型曲線下面積(AUC)為0.889(95％CI：0.818～0.960，P＜0.001)，閡值為0.41時(shí)敏感度為0.882，特異度為0.818，較單獨(dú)循環(huán)miR-149預(yù)測價(jià)值高。
　　結(jié)論：
　　1.主動(dòng)脈弓縮窄導(dǎo)致左心負(fù)荷增高和左心功能降低的同時(shí)，引起肺動(dòng)脈壓輕度增高和右心功能損害。
　　2.主動(dòng)脈弓縮窄導(dǎo)致左心負(fù)荷增高和左心功能降低時(shí)，肺組織microRNA表達(dá)譜發(fā)生變化，其中r

17、no-miR-143-3p、rno-miR-181a-5p、mo-miR-125b-1-3p上調(diào)，rno-miR-206-3p、rno-let-7b-5p、rno-miR-200b-3p、rno-miR-21-5p、rno-let-7b-5p、rno-miR-149-3p下調(diào)，KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)芯片篩選的差異變化microRNA靶基因的功能集中于TGF-β信號(hào)通路。
　　3.動(dòng)物模型中TAC組大鼠肺組織和循環(huán)miR-149水