高濃度rhBMP-2m復性條件的探討.pdf

1、目的：
　　骨形成蛋白2（bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2）是骨形成蛋白（bonemorphogeneticprotein,BMP）家族的一員。目前，已經發(fā)現(xiàn)15種以上不同的人BMP。其中以人BMP－2誘骨活性最強，并與其他BMP有協(xié)同作用。BMP2的活性形式是二聚體，在BMP成熟肽單鏈中有七個半胱氨酸殘基，形成三個肽鏈內二硫鍵，兩條肽鏈間再通過一個二硫鍵連接后才具有活性。
　　大腸桿菌是最常

2、用的基因工程表達系統(tǒng)。雖然它不能象真核系統(tǒng)一樣進行翻譯后加工，但由于其遺傳背景清楚、使用安全、操作簡單、產量高、生產周期短和成本低的優(yōu)點，現(xiàn)在仍是使用最廣泛，不可替代的表達系統(tǒng)。用真核表達的rhBMP-2m雖然活性很好，但是其生產成本太高，產品昂貴，難于大規(guī)模生產，限制了其臨床的應用。我們采用大腸桿菌系統(tǒng)非融合表達目的蛋白rhBMP-2m，其表達產量高，但是由于大腸桿菌本身的特性使其表達產物以無活性的包含體形式存在。這就需要進一步的復性

3、才能得到有活性的目的蛋白。由于成熟的活性二聚體BMP是有7個二硫鍵、疏水性強的分子，其復性難度大，至今還沒有理想的方法。本文就是在高密度發(fā)酵，純化rhBMP-2m的基礎上進行rhBMP-2m的復性方法的探討，找出適合rhBMP-2m復性的方法，然后進行細胞的測活，檢驗復性效果。
　　方法：
　　1.rhBMP-2m的高密度發(fā)酵：用15LNBS發(fā)酵罐，采用恒溶氧－補料分批培養(yǎng)的方法進行DH5α/pDH2-BMP-2m的高密度發(fā)

4、酵。在發(fā)酵過程中始終保持溶氧40％，pH7.0。32℃生長6h后，恒速添加補料。16h后將溫度在最短時間內升高到42℃誘導表達4h，結束發(fā)酵。
　　2.rhBMP-2m的純化：高密度發(fā)酵后的菌液，用STE、溶菌酶、脫氧膽酸鈉和超聲裂菌后，用TrionX-100進行4次包含體的超聲處理和洗滌。經洗滌的包含體進行SP-SepharoseFF陽離子柱層析和Q-SepharoseFF陰離子柱層析兩次純化。
　　3.rhBMP-2m的

5、復性：按朱幫福建立的BMP活性檢測方法（國家專利ZL01131813.9），經純化后的目的蛋白rhBMP-2m在不同的溫度、復性液pH、氧化交換系統(tǒng)濃度、鹽濃度等條件下進行透析復性。透析復性后進行非還原的SDS-PAGE,檢測rhBMP-2m活性形式二聚體的含量，同時找出相對較優(yōu)的復性方法并對其復性產物進行0.22μm微孔濾膜除菌并計算其損失率。
　　4.復性后rhBMP-2m活性鑒定：將復蘇后的C2C12細胞培養(yǎng)48h后按1×1

6、05個細胞接種于24孔板上，將每個樣品分3個濃度梯度(0.2mg/mL，0.02mg/mL，0.002mg/mL)加入。另每個樣品設立2個對照孔。1個為空白對照，只加入培養(yǎng)液；1個為復性前樣品(濃度為1mg/ml)。在二氧化碳溫箱中37℃培養(yǎng)24h后檢測其熒光值，對比復性前后rhBMP-2m的活性變化。
　　結果與討論：
　　1.rhBMP-2m的高密度發(fā)酵：經高密度發(fā)酵后，發(fā)酵液的OD600值為60.5，4L發(fā)酵液離心收集

7、的菌體濕重為386g。SDS-PAGE后經灰度掃描，目的蛋白占菌體總蛋白的20％。發(fā)酵過程中菌種接種濃度、接種時的無菌環(huán)境、培養(yǎng)基的成分、補料的成分、流加的方式及流加速度、pH、溶氧和溫度等因素對高密度發(fā)酵的結果均有影響，在發(fā)酵過程中要控制發(fā)酵的每個環(huán)節(jié)并優(yōu)化每個影響因素才能得到理想的結果。而且試管搖菌誘導表達時目的蛋白占總蛋白質的比例一般都高于高密度發(fā)酵的誘導表達，表明我們的高密度發(fā)酵和表達的條件還沒有很好地優(yōu)化。
　　2.rh

8、BMP-2m的純化：高密度發(fā)酵后目的蛋白純度為20％，經四次包含體洗滌后的純度達到75％，回收率為51.19％。洗滌后的包含體經陽離子柱層析純化后純度達到85％，總回收率為32.23％。再次經陰離子柱層析后純度達到95％，總回收率為19.70％。從洗滌和純化數(shù)據(jù)中我們可以看出，包含體洗滌和純化的次數(shù)越多，蛋白純度越高但其損失也越大。所以純化時要綜合考慮蛋白的性質、所需蛋白的純度、蛋白回收率和純化的成本以選擇適合的純化方法。
　　3

9、.rhBMP-2m的復性：本實驗探討了不同因素對rhBMP-2m復性的影響，包括pH、溫度、蛋白的濃度等。我們發(fā)現(xiàn)復性的pH、溫度對蛋白復性的結果影響很大，但鹽濃度、氧化交換系統(tǒng)的濃度和透析外液體積對蛋白復性影響不是很大。pH8.5時復性效率較高，二聚體的含量達到了30％；而pH4.8時rhBMP-2m完全可溶。低溫4℃有利于復性蛋白的正確折疊，其二聚體含量達到30％。在高的蛋白濃度10mg/ml時復性效率可以和0.1mg/ml蛋白濃度

10、的復性效率相當，而高濃度有利于復性后蛋白的濃縮回收，減少復性rhBMP的損失，降低工作強度，節(jié)省工作時間，從而有利于工業(yè)放大。在透析除尿素的過程中我們進一步發(fā)現(xiàn)，透析復性時rhBMP-2m的濃度最大只能達到6mg/ml，超過這一濃度即使改變pH，在除去變性劑尿素時目的蛋白都會沉淀析出?？紤]到復性時rhBMP-2m的可溶性及后續(xù)的濃縮回收，我們采用6mg/ml高蛋白濃度的改變pH的方法進行透析復性，實現(xiàn)了高pH（pH8.5）條件下復性后，

11、在低pH（pH4.8）條件下用一步透析和分步透析除變性劑尿素。用合適的蛋白濃度及改變pH的透析復性較好的解決了rhBMP-2m的可溶性問題，使得過濾除菌成為可能。實驗結果也證實經該方法復性后微孔濾膜除菌蛋白損失很小不超過10％。經一步透析和分步透析除尿素的方法對復性后rhBMP-2m的活性形式二聚體的含量沒有影響。這復性方案解決了以往稀釋法等低蛋白濃度復性后濃縮時rhBMP嚴重損失和應用時難以除菌的難題。
　　4.復性后rhBMP

12、-2m的活性鑒定：同時細胞測活顯示兩組活性均較復性前的蛋白有明顯的升高復性前rhBMP-2m熒光值為5左右，復性后20μg/mL的rhBMP-2m經一步透析除尿素和分步透析除尿素的熒光值達到最大均為20左右。經T檢驗（p<0.001）可以看出復性前后rhBMP-2m的活性有顯著差別，但是一步與分步除尿素兩者之間的細胞活性并沒有明顯的差別(p>0.005)。
　　雖然理論上推測一步透析除尿素使得rhBMP-2m的環(huán)境改變劇烈會引起二