柿葉提取物對(duì)阿爾茨海默病細(xì)胞模型的抗氧化作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景
　　隨著世界老齡化的不斷加劇，衰老及相關(guān)退行性相關(guān)的疾病受到越來越多研究者的重視。神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病在衰老疾病中占重要分支，如帕金森氏病，阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)等。AD是一種以認(rèn)知功能障礙、人格改變?yōu)橹饕R床癥狀的慢性進(jìn)展性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是癡呆的最常見原因。AD發(fā)病機(jī)制尚不明確，且無特效藥。為了更好的防治衰老疾病、提高老年人生活質(zhì)量、減輕社會(huì)負(fù)擔(dān)，探討退行性病變的病理機(jī)制、

2、研發(fā)有效延緩?fù)诵羞M(jìn)程的藥物有重要意義。
　　淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)是AD治病機(jī)制中的重要假說。不可溶的β淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)聚集而成的原纖維具有神經(jīng)毒性，也是老年斑的組成成分。Aβ聚合會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，線粒體功能受損，使ROS增多。而氧化應(yīng)激又會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)Aβ聚集及微管相關(guān)蛋白tau的磷酸化，加重AD大腦中的氧化還原反應(yīng)的失衡。氧化應(yīng)激是將多種不同的致病機(jī)制聯(lián)絡(luò)在一起的共同關(guān)鍵點(diǎn)，因此尋找合適的抗氧

3、化劑和多靶點(diǎn)的治療方法，進(jìn)行適當(dāng)?shù)呐R床干預(yù)，是防治AD的有效手段。
　　Nrf2/HO-1在機(jī)體內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)中有至關(guān)重要的地位，是最重要的抗氧化通路。Nrf2作為轉(zhuǎn)錄因子能啟動(dòng)機(jī)體的抗氧化通路。在受到氧化刺激時(shí)，Nrf2由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位進(jìn)入胞核，啟動(dòng)抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)，通過調(diào)控下游氧化還原基因網(wǎng)，來維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡。HO-1是Nrf2下游的抗氧化酶之一，通過對(duì)線粒體功能的恢復(fù)起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。Nrf2/HO-1是

4、機(jī)體維持氧化平衡的保護(hù)系統(tǒng)。
　　近來發(fā)現(xiàn)，柿葉具有抗氧化，降血脂，降血糖，抗菌，止血等藥效。臨床病例分析報(bào)道，柿葉提取物在改善后循環(huán)缺血的療效上優(yōu)于銀杏葉提取物。由柿葉提取物制成的腦心清片，可清除氧自由基，防止神經(jīng)元興奮性毒性作用，從而保護(hù)腦血管意外引起的腦損傷。在臨床治療中柿葉提取物已被廣泛應(yīng)用，尤其在腦血管病的相關(guān)領(lǐng)域中嶄露頭角。我們前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柿葉提取物(Persimmon leaf extract，PLE)可以改善

5、D-半乳糖致衰老小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力，提高抗氧化酶SOD，GSH-Px活性，那么在神經(jīng)細(xì)胞中尤其是AD細(xì)胞模型中，是否也有相同的作用？是否可以通過減少Aβ的聚集、減輕ROS的活性，調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1的表達(dá)來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用？
　　基于以上背景，本研究主要探討柿葉提取物對(duì)AD細(xì)胞模型的是否有抗氧化作用，以及Nrf2和HO-1是否參與到抗氧化的調(diào)節(jié)中，為AD的藥物研發(fā)提供依據(jù)。
　　目的:
　　采用攜帶瑞典突變APP基

6、因的HEK293細(xì)胞(20E2)作為AD細(xì)胞模型，通過檢測(cè)細(xì)胞上清Aβ1-42的水平，細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度，線粒體膜電位的變化等相關(guān)指標(biāo)，探討PLE對(duì)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的作用，并從核Nrf2/HO-1信號(hào)通路研究其作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.Western Blotting檢測(cè)SH-SY5Y和20E2細(xì)胞中APP蛋白表達(dá)水平;ELISA檢測(cè)兩組細(xì)胞上清Aβ1-40，以確定該病理模型是否建立成功。
　　2.CCK-8檢

7、測(cè)不同濃度的PLE對(duì)兩組細(xì)胞活性的影響，選定干預(yù)最佳濃度。
　　3.設(shè)分組:SH-SY5Y為空白對(duì)照組（NC組）20E2為模型組（20E2組），用柿葉提取物干預(yù)為加藥組（20E2+PLE組）。
　　4.DCFH-DA探針檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS的變化。
　　5.JC-1檢測(cè)線粒體膜電位的變化。
　　6.ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞上清Aβ1-42的量。
　　7.Western Blotting分析胞核Nrf2、胞漿N

8、rf2和全細(xì)胞HO-1蛋白的表達(dá)差異。
　　結(jié)果:
　　1.檢測(cè)兩種細(xì)胞中的APP、Aβ1-42蛋白表達(dá):
　　與SH-SY5Y細(xì)胞相比，20E2細(xì)胞APP表達(dá)量明顯增加(P＜0.01)，Aβ1-40的量明顯增加(P＜0.01)。
　　2.CCK-8檢測(cè)不同濃度的PLE對(duì)兩組細(xì)胞活性的影響:
　　結(jié)果顯示PLE在1.5-6μ g/mL可增加SH-SY5Y細(xì)胞活性（*P＜0.05）;PLE在3-6μg/mL可

9、增加20E2細(xì)胞活性(＃P＜0.05)，超過6μg/mL后也有抑制細(xì)胞活性的趨勢(shì)。
　　3.DCFH-DA熒光探針檢測(cè)各組細(xì)胞ROS的表達(dá):
　　與NC組相比，20E2組細(xì)胞內(nèi)ROS熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)(P＜0.05);PLE干預(yù)后，20E2+PLE組ROS熒光信號(hào)減弱(P＜0.05)。
　　4.JC-1檢測(cè)線粒體膜電位結(jié)果:
　　較NC組細(xì)胞，20E2組細(xì)胞，紅色熒光較弱(P＜0.05)，綠色熒光較強(qiáng)(P＜0.05

10、)，線粒體膜電位降低;用PLE干預(yù)后，20E2+PLE組細(xì)胞內(nèi)的紅色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(P＜0.05)，綠色熒光較弱(P＜0.05)，線粒體膜電位有上升。
　　5.ELISA檢測(cè)細(xì)胞外Aβ1-42濃度結(jié)果:
　　與NC組細(xì)胞相比，20E2組細(xì)胞外Aβ1-42明顯增多(P＜0.05);PLE干預(yù)后，20E2+PLE組細(xì)胞外Aβ1-42明顯減少(P＜0.05)。
　　6.分析胞核Nrf2、胞漿Nrf2和全細(xì)胞蛋白HO-1的表達(dá)差

11、異:
　　相比于NC組，20E2細(xì)胞中Nrf2蛋白和HO-1蛋白表達(dá)增多(P＜0.05);相比于模型組，加藥組中胞核Nrf2表達(dá)增加，胞漿Nrf2表達(dá)減少，全細(xì)胞蛋白HO-1增多(P＜0.05)
　　結(jié)論
　　PLE能明顯降低細(xì)胞外Aβ的濃度，減少ROS的產(chǎn)生，恢復(fù)線粒體膜電位水平。可能是通過激活了Nrf2/HO-1信號(hào)途徑，促進(jìn)Nrf2合成和核轉(zhuǎn)位，從而促進(jìn)下游抗氧化蛋白HO-1的表達(dá)來減弱氧化應(yīng)激的損傷。因此，PL