人牙髓及牙周膜干細(xì)胞對阿爾茨海默病細(xì)胞模型的治療作用研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是發(fā)生于老年和老年前期、以進行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，其主要臨床表現(xiàn)是記憶力、認(rèn)知功能、人格及語言功能逐漸下降。AD有兩個典型的組織病理學(xué)改變?yōu)槔夏臧?Senile plaque，SP)和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(Neurofibrillary tangles，NFT)，其中過度磷酸化的微管Tau蛋白于神經(jīng)元內(nèi)高度螺旋化是形成NFT的主要原因。目前對于A

2、D的治療方法主要以對癥治療為主，包括藥物治療和非藥物治療用以改善認(rèn)知功能和控制精神癥狀，減少并發(fā)癥，尚不能有效控制病程發(fā)展、治愈疾病。隨著干細(xì)胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的發(fā)展，已有多種干細(xì)胞用于治療AD的研究報道，顯示出良好的效果和臨床應(yīng)用前景。但探尋更理想的種子細(xì)胞，仍然是AD干細(xì)胞治療的重要課題。牙髓干細(xì)胞(Dental pulp stem cells，DPSCs)和牙周膜干細(xì)胞(Periodontal ligament stem cells，PD

3、LSCs)是來源于神經(jīng)嵴的牙源性干細(xì)胞，相比于臍帶等中胚層來源的干細(xì)胞，具有更加明顯的神經(jīng)分化潛能，而且，DPSCs和PDLSCs具有可自體取材，免疫原性低等優(yōu)點，在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面更具優(yōu)勢。目前體內(nèi)和體外許多研究都證實DPSCs和PDLSCs能夠幫助預(yù)防和修復(fù)神經(jīng)損傷，而DPSCs在治療帕金森、大腦損傷和脊髓損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面已取得一定療效，但它們對AD的治療作用研究尚未見報道。本研究通過岡田酸(Okadaicacid，O

4、A)損傷SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞系，建立AD體外細(xì)胞模型，在此基礎(chǔ)上系統(tǒng)研究DPSCs和PDLSCs對AD細(xì)胞模型的治療效果，以期為DPSCs與PDLSCs用于AD治療提供理論和實驗依據(jù)。
　　研究的主要方法和結(jié)果如下:
　　1.分別采用酶消化法和組織塊法原代培養(yǎng)分離人DPSCs、PDLSCs和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)，單細(xì)胞克隆培養(yǎng)純化DPS

5、Cs和PDLSCs;倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，CCK-8比較細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞儀和免疫熒光染色檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物。體外誘導(dǎo)這3種干細(xì)胞向成骨、成脂和成軟骨方向分化，通過細(xì)胞形態(tài)變化、特異性染色(堿性磷酸酶、茜素紅染色和Von Kossa染色，油紅O染色，阿爾辛藍(lán)和HE染色)分別鑒定誘導(dǎo)細(xì)胞成骨、成脂、成軟骨分化能力，進一步實時熒光定量PCR檢測比較3種細(xì)胞成骨相關(guān)基因OCN和RUNX2及成脂相關(guān)基因PPAR-γ的表達(dá)水平。結(jié)果顯示:這

6、3種間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)細(xì)胞形態(tài)略有不同，但細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白表達(dá)相似，均陽性表達(dá)CD166、CD105、CD44、CD73和CD90以及間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記vimentin和α-SMA;而DPSCs和PDLSCs增殖能力顯著高于UCMSCs;三者均可向成骨、成脂和成軟骨誘導(dǎo)分化，但分化能力不同。成骨分化能力由強至弱依次為DPSCs、UCMSCs、PDLSCs;成脂分化能力DPSCs分化能力最強

7、，UCMSCs次之，PDLSCs相對較弱;成軟骨分化能力比較發(fā)現(xiàn):與DPSCs相比，UCMSCs和PDLSCs分化能力更強。
　　2.采用倒置相差顯微鏡觀察和CCK-8檢測不同濃度OA溶液與神經(jīng)細(xì)胞系SH-SY5Y孵育24h細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞活性變化，確定建立細(xì)胞模型的最佳給藥濃度。用確定的OA濃度(20nmol/L)孵育SH-SY5Y細(xì)胞系24h，建立細(xì)胞損傷AD體外模型。再通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、CCK-8檢測細(xì)胞活性、Hoe

8、chst33258熒光染色細(xì)胞凋亡率、激光共聚焦顯微鏡分析α-tubulin和鬼筆環(huán)肽特染的細(xì)胞骨架、透射電鏡觀察細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)以及蛋白免疫印跡分析細(xì)胞Tau蛋白磷酸化水平的變化。結(jié)果顯示:篩選確定20nmol/L OA作用24h是建立AD細(xì)胞模型適宜的作用濃度和作用時間。從形態(tài)看，20nmol/L OA損傷SH-SY5Y細(xì)胞24h后，其細(xì)胞表面形態(tài)改變，細(xì)胞突觸斷裂消失;同時，細(xì)胞活性顯著下降，凋亡率上升;微管、微絲結(jié)構(gòu)明顯改變，表現(xiàn)為

9、樹突退縮消失，微管塌陷疏松，微絲排列紊亂，含量明顯降低，這些變化均與對照組有顯著性差異，蛋白免疫印跡半定量分析結(jié)果也顯示OA增強了細(xì)胞Ser396位點磷酸化Tau蛋白水平。通過多角度、多層次觀察分析，結(jié)果表明:20nmol/L OA損傷SH-SY5Y細(xì)胞24h所建立AD細(xì)胞模型是可靠的。
　　3.采用Transwell小室及條件培養(yǎng)基共孵育的方式，分別研究DPSCs和PDLSCs對AD細(xì)胞模型的治療作用。實驗通過比較對照組、模型組

10、和治療組細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞骨架、細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白磷酸化水平等指標(biāo)來評價DPSCs和PDLSCs對AD細(xì)胞模型的治療效果。研究結(jié)果顯示:分別經(jīng)DPSCs和PDLSCs治療后，OA損傷的細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)，回縮的樹突重新伸長;細(xì)胞數(shù)量增多，活性增強;樹突長度、細(xì)胞活性及細(xì)胞凋亡檢測均顯示治療組與模型組結(jié)果有顯著性差異。進一步激光共聚焦發(fā)現(xiàn):治療組樹突粗壯較長，凋亡細(xì)胞少見，核形態(tài)圓而規(guī)則，顯色均勻，類似對照組;

11、α-tubulin、F-actin特染顯示治療組微絲致密規(guī)則，微管纖維變粗，結(jié)構(gòu)與對照組無明顯差異。透射電鏡下可見治療組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)微管結(jié)構(gòu)清晰、排列有序，與對照組相似。同時，蛋白質(zhì)免疫印跡也發(fā)現(xiàn)治療組細(xì)胞Tau蛋白的Ser396位點磷酸化水平降低。這些結(jié)果表明: DPSCs和PDLSCs治療OA損傷所致的AD細(xì)胞模型，從細(xì)胞形態(tài)、生物活性、微管結(jié)構(gòu)及功能方面均顯示良好的治療效果。
　　綜上所述，本研究的結(jié)論是:(1)不同組織來源的M

12、SCs具有不同的生物學(xué)特性，牙髓、牙周膜及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在增殖和三系分化能力上存在差異;(2)20nmol/L OA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞系24h可建立可靠的AD樣細(xì)胞模型，用于AD體外研究;(3)DPSCs和PDLSCs對OA誘導(dǎo)的AD細(xì)胞模型均有顯著治療作用，其機制與這兩種細(xì)胞分泌的多種生長因子可拮抗Tau蛋白磷酸化有關(guān)。本研究結(jié)果表明DPSCs和PDLSCs作為牙源性MSCs用于治療AD獨具優(yōu)勢，為臨床AD治療提供了新思路、新方