阿爾茨海默病小鼠模型中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)分化.pdf

1、背景和目的：
　　阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)是老年人癡呆常見(jiàn)的類(lèi)型，病理特征主要為老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、海馬椎體細(xì)胞顆?？张葑冃约吧窠?jīng)元缺失。主要臨床特征是進(jìn)行性智能減退，多伴有人格改變，并且發(fā)病率隨年齡逐漸增高。阿爾茨海默病協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示:在美國(guó)約有520萬(wàn)AD患者，其中年齡小于65歲的AD患者約有20萬(wàn)，其余500萬(wàn)AD患者年齡均在65歲之上。隨著生育高峰期的出現(xiàn)，在接下來(lái)的幾十年將有約1

2、000萬(wàn)美國(guó)人新發(fā)展為AD。目前在美國(guó)約每68秒就有一人發(fā)展為AD患者，預(yù)計(jì)到2050年，AD的發(fā)病頻率將有所增加，約每33秒就有一人發(fā)展為AD患者。在美國(guó)，AD是所有致死原因的第六位，而在年齡65歲以上（包括65歲）的人中，AD排在第五位。在過(guò)去的十年中，由心臟疾病、卒中和前列腺癌所導(dǎo)致死亡人數(shù)的比例分別下降16％、23％和8％，而AD所致死亡人數(shù)的比例增加了約68％。AD除了給患者本人帶來(lái)了嚴(yán)重的健康問(wèn)題、生活質(zhì)量和工作能力的下降，

3、也給其家人帶來(lái)了嚴(yán)峻的考驗(yàn)，除了需要花費(fèi)人力對(duì)AD患者進(jìn)行專(zhuān)心的看護(hù)外，昂貴的經(jīng)濟(jì)費(fèi)用也讓很多家庭難以承受。但AD的病因迄今不明，發(fā)病的具體機(jī)制也不十分清楚。目前尚無(wú)特效的治療方法可以逆轉(zhuǎn)或阻止AD的發(fā)展。即使給予治療，患者病情仍會(huì)逐漸進(jìn)展。因此，如果想要改變AD現(xiàn)在的情況，則急需研究出新的有效的治療方案?，F(xiàn)有的研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)在一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病如神經(jīng)退行

4、性疾病的治療中發(fā)揮作用。自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，因具有易獲得和沒(méi)有免疫排斥反應(yīng)的特點(diǎn)，可能成為細(xì)胞移植的極好選擇。但是廣泛存在的Notch1信號(hào)通路能夠抑制干細(xì)胞的神經(jīng)分化，Notch1與AD特異性蛋白APP被同一種酶水解，在A(yíng)D患者M(jìn)SCs神經(jīng)分化過(guò)程中是否存在Notch1和APP的交互作用，尚不清楚。此外，自噬是一種通過(guò)非選擇性溶酶體途徑的自我降解過(guò)程，是神經(jīng)元生理功能維持必需的，在A(yíng)D中發(fā)揮重要作用。但是，在A(yíng)D患者進(jìn)行自體MSCs

5、移植后，自體同源MSCs神經(jīng)分化過(guò)程是否存在自噬缺陷仍未可知。因此，通過(guò)自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植來(lái)治療AD，這一方案能否取得決定性的勝利還是一個(gè)未知數(shù)。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)是骨髓組織中的一種基質(zhì)細(xì)胞，由Friedenstein在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的一種梭形細(xì)胞。在骨髓組織中，MSCs的數(shù)量不是很多，但其在造血干細(xì)胞的存活和功能維持等方面起重要作用。除此之外，MS

6、Cs還是一種擁有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞。MSCs能夠分化為不同的細(xì)胞，比如可以向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等分化。目前研究的MSCs多來(lái)源于骨髓、脂肪組織和臍帶血等組織。MSCs的多向分化潛能使其在眾多疾病的診治中占有重要地位。特別是在神經(jīng)系統(tǒng)病變中，如神經(jīng)退行性病變和缺血缺氧性腦病等疾病，MSCs為其新的有效的治療帶來(lái)了希望。目前雖然認(rèn)為自體MSCs移植可能是一種安全有效的方法，但是，MSCs向神經(jīng)細(xì)胞橫

7、向分化的過(guò)程中仍存在許多問(wèn)題，需要進(jìn)一步深入研究。
　　因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠模型（APP轉(zhuǎn)基因小鼠），來(lái)觀(guān)察體外誘導(dǎo)AD小鼠模型的MSCs的神經(jīng)分化特點(diǎn)，從而探討其與調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化的Notch1信號(hào)通路的關(guān)系，并觀(guān)察分化后的MSCs中自噬的變化情況。
　　材料和方法：
　　建立APP轉(zhuǎn)基因小鼠模型。體外培養(yǎng)小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為兩組:APP組（即MSCs取自APP轉(zhuǎn)基因小鼠）和WT組（即M

8、SCs取自野生型小鼠）。采用β-巰基乙醇誘導(dǎo)小鼠MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞;采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)誘導(dǎo)后β淀粉樣蛋白40(Aβ40)和42(Aβ42)的水平;采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法和Western blot檢測(cè)神經(jīng)標(biāo)志蛋白神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)微管結(jié)合蛋白(MAP-2)的表達(dá)變化;Western blot檢測(cè)Notch1信號(hào)通路各節(jié)點(diǎn)分子Notch-1、Notch細(xì)胞內(nèi)片段(NICD)和Hes5的水平及誘導(dǎo)分化后自噬的

9、特異性標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)的表達(dá)變化。在誘導(dǎo)分化完成后，采用雷帕霉素誘導(dǎo)自噬，并用Western blot分析不同時(shí)間點(diǎn)自噬選擇性底物P62的水平。
　　結(jié)果：
　　1.β-巰基乙醇可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，其中以APP組最佳，神經(jīng)標(biāo)志蛋白神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)微管結(jié)合蛋白（MAP-2）顯著高于WT組(P＜0.05)。
　　2.誘導(dǎo)分化后，APP組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有更強(qiáng)Aβ表達(dá)能力，在

10、APP組誘導(dǎo)培養(yǎng)液中可檢測(cè)到Aβ40和Aβ42的濃度分別是(23.2±3.5)ng/L，（3.3±0.6）ng/L，而在WT組的誘導(dǎo)培養(yǎng)液中未檢測(cè)到。
　　3.誘導(dǎo)分化前，APP組Notch1信號(hào)通路活性低于WT組，APP組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中Notch1信號(hào)通路各節(jié)點(diǎn)分子Notch-1、NICD和Hes5的表達(dá)顯著低于WT組(P＜0.05)。誘導(dǎo)分化后，兩組Notch1信號(hào)通路均受到抑制，以APP組更甚。兩組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中No

11、tch-1、NICD和Hes5的表達(dá)均低于誘導(dǎo)前，且APP組顯著低于WT組(P＜0.05)。
　　4.誘導(dǎo)后，可見(jiàn)LC3陽(yáng)性熒光點(diǎn)的聚集，APP組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ表達(dá)顯著高于WT組。自噬誘導(dǎo)前后APP組MSCs中自噬選擇性底物P62的水平無(wú)明顯改變，但顯著高于WT組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　過(guò)表達(dá)APP可能通過(guò)抑制Notch1信號(hào)通路增強(qiáng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)分化能力，而分化后的AP