人羊膜間充質(zhì)干細胞移植治療阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因鼠的實驗研究.pdf

1、背景與目的:阿爾茨海默病(AD)又稱老年癡呆,其主要癥狀是記憶力進行性減退,并伴有不同程度的認知、語言和人格方面的異常。年齡是AD最主要的危險因素,70歲后每增加5歲,AD發(fā)生的危險性增加1倍,80歲后約50％的人有發(fā)生AD的危險。隨著人類平均壽命的延長,世界人口日趨老齡化,老年期癡呆的發(fā)病率也隨之增加。老年癡呆已成為繼心臟病,腫瘤,中風后的人類第四大殺手。目前研究者已經(jīng)制作出各種阿爾茨海默病動物模型,希望能夠找到治療阿爾茨海默病的有效

2、方法。其中主要有自然衰老動物模型、Aβ注射動物模型、缺氧所致動物模型、慢性缺血動物模型、膽堿能損害動物模型、鋁中毒動物模型等,但是這些動物模型只是部分的模擬了阿爾茨海默病的病理變化或者是阿爾茨海默病的癥狀,而且這些動物模型價格昂貴,難飼養(yǎng)易死亡,使其在阿爾茨海默病的研究應用中受到了很大的限制。轉(zhuǎn)基因動物模型的最明顯的優(yōu)點是模擬了AD樣神經(jīng)病理學特征,包括細胞外Aβ的沉積,營養(yǎng)不良性神經(jīng)炎成分,神經(jīng)膠質(zhì)增生。轉(zhuǎn)基因小鼠可能提供一個分析Aβ

3、沉積機制和驗證AD的治療效果的較好的動物模型。
　　目前老年癡呆的治療主要包括膽堿能藥物、腦細胞代謝激活劑、腦血循環(huán)促進劑、鈣離子拮抗劑、神經(jīng)營養(yǎng)因子以及抗氧化劑等,但療效均不佳。Zhang等將人胚胎干細胞培養(yǎng)成具有神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞分化潛能的神經(jīng)干細胞,在移植入新生鼠大腦后,發(fā)現(xiàn)這些神經(jīng)干細胞能整合入受體鼠腦,并能分化為3種神經(jīng)細胞;有文獻將人神經(jīng)干細胞移植到出生后24個月的大鼠側(cè)腦室,4周后這些細胞有序地遷移到

4、大腦皮質(zhì)和海馬,并分化為神經(jīng)細胞和星形膠質(zhì)細胞,部分細胞可和宿主細胞建立突觸聯(lián)系,并能顯著改善衰老大鼠的認知功能。目前,神經(jīng)干細胞移植已廣泛應用于各種神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的實驗研究,應用體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合治療阿爾茨海默病大鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)可促進大鼠學習記憶能力的恢復。骨髓基質(zhì)細胞移植治療血管性癡呆也取得了一定的效果。人羊膜間充質(zhì)干細胞免疫原性較小,可能比較適合于異體移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究,但涉及人羊膜間充質(zhì)干細胞

5、用于老年癡呆的國內(nèi)外報道少見。本實驗旨在探討人羊膜間充質(zhì)干細胞對阿爾茨海默病的治療作用。
　　方法:①人羊膜間充質(zhì)干細胞的提取、純化、培養(yǎng):無菌條件下取正常足月剖腹產(chǎn)胎兒的羊膜,PBS充分沖洗后剪成碎片,用0.25％的胰蛋白酶室溫消化1h,棄去胰蛋白酶,然后用含1.0g/L的膠原酶Ⅳ的DMEM/F12培養(yǎng)液37℃消化2h,制成單細胞懸液,臺盤蘭染色,計數(shù)活細胞,以2×105個/ml接種于75ml培養(yǎng)瓶內(nèi)。培養(yǎng)基采用VDMEM:VF

6、12=1:1的DMEM/F12加10％的胎牛血清(FBS)、bFGF(終濃度為20ng/ml),將細胞培養(yǎng)瓶置于37℃、飽和濕度、體積分數(shù)為5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72h后,更換培養(yǎng)液,棄去未貼壁的細胞,根掘細胞生長情況,每3-4天全量換液一次。待細胞達到80％-90％融合時,用0.25％的胰酶消化,然后按1:3的比例進行傳代接種培養(yǎng),并記為P1代。傳代培養(yǎng)過程中每3d全量換液,直至貼壁細胞彼此融合,鋪滿瓶底,再重復上述操作,傳代

7、培養(yǎng)記為P2代,其余類推。②人羊膜間充質(zhì)干細胞的鑒定:將人羊膜間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)至第三代,行Nestine免疫細胞化學染色。③流式細胞儀分析細胞表面標記:將人羊膜間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)至第三代,流式細胞儀分析細胞表面標記CD40、CD80、CD86。④實驗動物分組:將經(jīng)過PCR技術(shù)鑒定過的小鼠分為3組,分別為移植組、對照組、正常組,移植組為10只APP+小鼠,雌雄各半,給予尾靜脈移植人羊膜間充質(zhì)干細胞治療;對照組為10只APP+小鼠,雌雄各半,

8、給予尾靜脈注射生理鹽水;正常組為9只APP-小鼠雌5雄4,未給予任何干預措施。⑤人羊膜間充質(zhì)干細胞的體外標記:待人羊膜間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)至第三代時,移植前,Brdu以3μg/ml終濃度加入hAMSCs細胞培養(yǎng)瓶37℃、5％CO2飽和濕度孵育箱中孵育24小時。移植時生理鹽水洗滌3次,1ml0.25％胰蛋白酶消化細胞30-60s,短時低速離心3次(1000prm,5min),去除懸液中的細胞碎片,用生理鹽水重新懸浮細胞,調(diào)整細胞濃度1×106

9、/ml備用。⑥人羊膜間充質(zhì)干細胞的尾靜脈移植:在第一輪morris水迷宮評價小鼠行為學情況之后進行,將第三代標記后的人羊膜間充質(zhì)干細胞制成濃度為1×106個/ml的單細胞懸液,用容量為1ml的注射器將體積為0.5ml的細胞懸液經(jīng)小鼠尾靜脈注入移植組小鼠體內(nèi),注射時間大于一分鐘,注射完成后留針10秒左右拔針。對照組小鼠給予注射同體積的生理鹽水,正常組小鼠不給予干預措施。⑦小鼠空間學習能力的測定(morris水迷宮)定位航行試驗:試驗開始前

10、將動物放入水池中(不含平臺),任其自由游泳兩分鐘,以熟悉適應迷宮環(huán)境。試驗共進行兩輪,細胞移植前和移植15天后各進行一輪,每輪試驗共歷時8天,每兩天訓練1遍,共4遍,每只動物每遍訓練4次,分別從四個象限池邊中點面壁放入,4個放入點隨機順序。記錄大鼠從入水到找到并爬上平臺的時間即逃逸潛伏期。若小鼠鼠在120秒內(nèi)未找到平臺則由實驗者將其引向平臺,潛伏期記為最高120秒。小鼠找到平臺后讓其在平臺上休息30秒后進行下一次試驗。每只小鼠每訓練一遍

11、4次的算術(shù)平均數(shù)即為此小鼠訓練一遍的逃逸潛伏期?？臻g探索試驗:于第9天撤除平臺,隨機選取兩點先后兩次面壁將小鼠投入水池中,分別攝像記錄小鼠兩次2min內(nèi)水中游泳路徑,用電腦分析計算小鼠兩次在平臺象限內(nèi)游泳的時間的平均值及穿過原平臺相應位置的次數(shù)的平均值。⑧鼠腦切片染色觀察各組小鼠腦內(nèi)β-淀粉蛋白的表達:分別于第一輪水迷宮測試前隨機取模型鼠和正常鼠及細胞移植后一個月每實驗組隨機取小鼠處死,取腦組織冠狀連續(xù)切片行甲醇剛果紅染色觀察三組小鼠腦

12、內(nèi)β-淀粉蛋白的表達情況。⑨鼠腦切片染色觀察移植組小鼠腦內(nèi)Brdu表達:細胞移植后一個月后將移植組小鼠處死,取腦組織蠟塊包埋,冠狀連續(xù)切片免疫組織化學染色觀察小鼠腦內(nèi)Brdu的表達。⑩鼠腦切片染色觀察各組小鼠腦內(nèi)GFAP、CHAT的表達:細胞移植后一個月將各實驗組小鼠處死,取腦組織冠狀連續(xù)切片行免疫組織化學染色觀察三組小鼠腦內(nèi)GFAP、CHAT的表達情況。
　　結(jié)果:①經(jīng)酶消化從羊膜分離的細胞于24 h內(nèi)貼壁,72 h細胞呈圓形、

13、梭形、星形和多角形等多種形態(tài),培養(yǎng)至6-7d,細胞達80％~90％融合,呈放射狀或漩渦狀分布;傳代后細胞3-4d鋪滿瓶底,傳至3代,細胞形態(tài)很均勻,長梭形,有偽足。②免疫細胞化學染色觀察可見人羊膜間充質(zhì)干細胞Nestine表達陽性,胞漿著棕褐色,胞核被染成藍色。③流式細胞儀分析細胞表面標記:人羊膜間充質(zhì)干細胞表面較低表達CD40、CD80、CD86。④在定位航行試驗中,移植前移植組與對照組之間無顯著差異(P>0.05),移植組與正常組之

14、間差異顯著(P<0.05);移植后移植組與對照組之間差異顯著(P<0.05),移植組與正常組之間無顯著差異(P>0.05)。探索實驗中,移植前后3組小鼠之間均無明顯差別(P>0.05)。⑤鼠腦冠狀切片甲醇剛果紅染色可見細胞移植前,模型鼠腦內(nèi)可見較多斑片樣β-淀粉樣蛋白的沉積,被染成淡粉色,而正常鼠腦內(nèi)則幾乎看不到β-淀粉樣蛋白的沉積;細胞移植后一個月,移植組小鼠腦內(nèi)白質(zhì)仍可見較多斑片樣β-淀粉蛋白的沉積,被染成淡粉色,但數(shù)量較對照組已明

15、顯減少,單個β-淀粉蛋白團塊面積也較對照組明顯減小,正常組小鼠腦內(nèi)幾乎未見β-淀粉蛋白的沉積。⑥鼠腦冠狀切片Brdu免疫組織化學染色可見移植組小鼠腦內(nèi)Brdu陽性細胞存在,細胞核染成棕黃色,胞漿呈淡藍色,陽性細胞聚集成團塊狀,分布未見有規(guī)律性。⑦移植后一個月,移植組小鼠腦內(nèi)GFAP、CHAT的表達與正常組差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與對照組比較差別亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:①用胰蛋白酶和膠原酶Ⅳ能夠從羊膜分

16、離MSCs,人羊膜MSCs可在含10％FBS和20μg/L bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基中進行體外擴增。②Brdu體外標記的人羊膜間充質(zhì)干細胞經(jīng)尾靜脈移植給阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)后可以存活,并能遷移至轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)發(fā)揮作用。③人羊膜間充質(zhì)干細胞移植可以減少阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白的沉積。④人羊膜間充質(zhì)干細胞移植治療可以改善阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學習記憶能力。⑤GFAP、CHAT的表達的變化可能是人羊膜間充質(zhì)