14型肺炎球菌莢膜多糖純化工藝的建立與優(yōu)化.pdf

1、肺炎球菌(Streptococcus Pneumoniae，SP)，簡稱肺炎球菌，是一種具有莢膜的革蘭氏陽性菌，是導致全球人類發(fā)病和死亡的主要致病菌之一，主要引起社區(qū)獲得性肺炎、中耳炎、腦膜炎以及敗血癥等疾病。目前已有利用其保護性抗原—肺炎球菌莢膜多糖(PnPS)制備的23價肺炎球菌莢膜多糖疫苗和7價、13價肺炎球菌多糖結合疫苗上市，以防御肺炎球菌對成人和嬰幼兒造成的感染。
　　論文以14型肺炎球菌為實驗材料，采用常規(guī)細菌學檢定方

2、法對其進行了篩選，挑出生物學特性典型、莢膜結構完整豐厚、與14型分型診斷血清凝集作用較強的31601-5菌株建立發(fā)酵的工作種子庫；以細菌生長菌密度、莢膜多糖產率等指標為依據，通過細菌發(fā)酵罐培養(yǎng)，對其適宜培養(yǎng)基成分、菌液接種量以及通氣方式等條件進行篩選與優(yōu)化。結果表明，以添加了天冬氨酸和谷氨酰胺的氨基酸培養(yǎng)基為基礎，在培養(yǎng)溫度為37℃，菌種接種量為10％、培養(yǎng)基pH值7.2、CO22 L/min及壓縮空氣3 L/min共同通氣培養(yǎng)的條件下

3、，14型肺炎球菌生長較好，菌密度達13.068，莢膜多糖產率可達到0.4 g/L。
　　其次，對14型肺炎球菌培養(yǎng)液的裂解工藝進行了優(yōu)化和驗證，通過觀察裂解濃度、裂解時間、裂解溫度對裂解效果的影響，最終確立了14型肺炎球菌發(fā)酵培養(yǎng)液的裂解工藝為：細菌光密度OD600值≤12時，細菌培養(yǎng)結束后，于培養(yǎng)液中加入脫氧膽酸鈉，使其終濃度為0.12%，置于18~22℃環(huán)境下靜置12~18h。
　　然后，將裂解液分別用乙醇分級沉淀法和C

4、TAB沉淀法進行純化，并檢測氨基己糖含量、蛋白質含量、核酸含量及免疫雙擴散法確定抗原活性，全面評價各種方法的純化效果，結果表明，乙醇分級沉淀法更適于14型肺炎球菌粗多糖的純化。
　　最后，對裂解液中的粗多糖分別用脫氧膽酸鈉法和苯酚抽提法進行處理后超濾、干燥。收獲凍干后的莢膜多糖，經全面分析后，確定14型肺炎球菌粗多糖的去蛋白質工藝為脫氧膽酸鈉法。工藝參數為：加入脫氧膽酸鈉，終濃度0.5%，調pH至5.0以下，離心取上清液，經100

5、Kd膜堆超濾后冷凍干燥收獲液。
　　論文還應用響應面法對14型肺炎球菌莢膜多糖的超濾工藝進行優(yōu)化。根據實際操作情況及經驗選取跨膜壓力、切向流量和多糖濃度作為自變量，以膜包處理能力作為響應值，先進行單因素試驗，考察跨膜壓力、切向流量、多糖濃度對膜包處理能力的影響，并初步確定曲線的拐點和試驗步長，再以單因素試驗為基礎，利用Box-Behnken設計進行響應面優(yōu)化組合，采用Design Expert軟件分析數據，確定最佳超濾工藝參數為：