大腸埃希氏菌K-12胞漿熱調(diào)節(jié)蛋白及其相關(guān)蛋白質(zhì)復(fù)合物的研究.pdf

1、細(xì)菌適應(yīng)熱環(huán)境的機(jī)制研究一直以來(lái)都是微生物學(xué)家研究的熱點(diǎn)，是研究細(xì)菌適應(yīng)外界環(huán)境變化的機(jī)制及其進(jìn)化的重要組成部分。然而前期的研究主要集中在熱激反應(yīng)階段，對(duì)熱激反應(yīng)過(guò)后細(xì)菌如何維持熱適應(yīng)的研究還較少。為此，本論文充分利用功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)和手段，對(duì)E.coli K-12維持熱適應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用的胞漿蛋白及其相關(guān)蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行研究，以期了解細(xì)菌維持熱適應(yīng)的調(diào)節(jié)蛋白及其蛋白調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而深入認(rèn)識(shí)細(xì)菌適應(yīng)熱環(huán)境的機(jī)制。 本論文首先

2、采用基于2-D native/SDS-PAGE的蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)不同溫度培養(yǎng)條件下的E.coli K-12胞漿蛋白進(jìn)行了比較分析，鑒定了6個(gè)差異表達(dá)蛋白GroL、ClpB、DnaK、Mdh、MalE和LysU，并利用基因工程技術(shù)制備多克隆抗體，進(jìn)而采用Western blotting技術(shù)驗(yàn)證這些蛋白的表達(dá)差異。 其次，通過(guò)2-D native/SDS-PAGE技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)和對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索，初步探索了6個(gè)熱調(diào)節(jié)蛋白相關(guān)的蛋白質(zhì)復(fù)

3、合物，并利用His-pull down技術(shù)驗(yàn)證了其中部分復(fù)合物：GroL-Tig-RpsA，DnaK-AspS和GapA-AnsB的相互作用關(guān)系。然后，利用基因敲除菌及高表達(dá)菌株初步研究了6個(gè)熱調(diào)節(jié)蛋白對(duì)E.coli K-12正常生長(zhǎng)及高溫下生長(zhǎng)的影響。 最后，采用2-D native/SDS-PAGE技術(shù)對(duì)6個(gè)熱調(diào)節(jié)蛋白對(duì)應(yīng)的基因敲除菌在不同溫度下的蛋白表達(dá)譜進(jìn)行比較分析，以研究熱調(diào)節(jié)蛋白相關(guān)的蛋白調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。利用質(zhì)譜技術(shù)共鑒定

4、出包括上述6個(gè)熱調(diào)節(jié)蛋白在內(nèi)的36個(gè)差異表達(dá)的蛋白。它們參與細(xì)菌能量代謝，信息處理等許多重要生理活動(dòng)，是細(xì)菌熱調(diào)節(jié)蛋白網(wǎng)絡(luò)的組成部分。這些熱調(diào)節(jié)蛋白不僅功能相關(guān)，在維持細(xì)菌熱適應(yīng)中發(fā)揮一定的作用，而且通過(guò)IntAct數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，我們發(fā)現(xiàn)其中大部分蛋白在生理上還存在著相互作用關(guān)系。 這些發(fā)現(xiàn)不僅有助于我們清楚地了解細(xì)菌維持熱適應(yīng)中的熱調(diào)節(jié)蛋白及其蛋白調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)細(xì)菌適應(yīng)熱環(huán)境的機(jī)制，而且對(duì)細(xì)菌適應(yīng)其他環(huán)境的研究也具有重要的