通過增加骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的定向歸巢和存活提高其治療急性心梗療效的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文主要從以下兩部分展開論述：
　　第一部分：口服強(qiáng)化阿托伐他汀聯(lián)合阿托伐他汀預(yù)處理提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性心肌梗死療效的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是進(jìn)行急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后心肌修復(fù)的一種有效的干細(xì)胞來源，但療效有限，原因之一是歸巢并存活于梗死心肌的MSCs數(shù)量較少?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子1(s

2、tromal cell-derived factor-1，SDF-1)與其特異性受體趨化因子受體4(CXCchemokine receptor4，CXCR4)構(gòu)成的SDF-1/CXCR4軸在MSCs歸巢、定植到損傷部位參與修復(fù)的過程中發(fā)揮重要作用。我們的前期研究表明，口服強(qiáng)化阿托伐他汀(atorvastatin，ATV)能改善梗死微環(huán)境促進(jìn)MSCs存活，而且ATV預(yù)處理能增加MSCs表面CXCR4的表達(dá)，提高M(jìn)SCs的歸巢能力。本研究旨

3、在探討口服強(qiáng)化ATV聯(lián)合移植ATV預(yù)處理的MSCs(ATV-MSCs)是否可以進(jìn)一步改善心梗后心功能，并明確其作用是否是通過SDF-1/CXCR4軸發(fā)揮的。
　　方法:第一部分將6-8周齡雌性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、心梗對照組(AMI)、AMI后口服強(qiáng)化ATV組，分別于AMI后1天、1周和2周取材，通過免疫組化、RT-PCR和ELISA測定梗死周邊心肌組織SDF-1的動(dòng)態(tài)變化，選擇SDF-1表

4、達(dá)高峰作為第二部分移植MSCs或ATV-MSCs的時(shí)間點(diǎn)。第二部分將大鼠隨機(jī)分為Sham組，AMI對照組，移植MSCs組，口服強(qiáng)化ATV組，移植ATV預(yù)處理的MSCs(ATV-MSCs)組，口服強(qiáng)化ATV聯(lián)合移植MSCs(ATV+MSCs)組，同時(shí)口服強(qiáng)化ATV聯(lián)合移植ATV預(yù)處理的MSCs(ATV+ATV-MSCs)組，ATV+ATV-MSCs+AMD3100(SDF-1/CXCR4阻滯劑)組。采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支的方法制作急性心肌

5、梗死模型，梗死后1周經(jīng)頸靜脈注射CM-Dil標(biāo)記的MSCs或ATV-MSCs(2×106細(xì)胞/只)。梗死后4周通過心臟超聲和左心導(dǎo)管檢測心功能;通過病理組織學(xué)檢測歸巢至梗死心肌的MSCs、炎癥細(xì)胞浸潤及纖維化，TUNEL法檢測凋亡;通過蛋白芯片檢測梗死周邊心肌組織中促炎和抗炎因子的水平;通過免疫熒光法檢測血管新生、內(nèi)源性c-Kit+干細(xì)胞的數(shù)量以及MSCs向心肌分化情況。
　　結(jié)果:與AMI組相比，口服強(qiáng)化ATV可顯著提高SDF-

6、1的mRNA和蛋白表達(dá)，在1周時(shí)達(dá)高峰，選擇1周作為MSCs移植時(shí)間點(diǎn)。與MSCs組相比，ATV-MSCs或ATV+MSCs組能夠顯著提高左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)和等容收縮期左室內(nèi)壓力上升的最大速率(dp/dt)，顯著降低左室舒張末期直徑(LVEDd)、左室收縮末期直徑(LVESd)和左室舒張壓力(LVEDP);ATV+ATV-MSCs組的LVEF和LVFS與ATV-MSCs組相比進(jìn)一步提高，LVEDP和dp

7、/dt與ATV-MSCs組和ATV+MSCs組相比均有顯著改善;而加入AMD3100阻斷SDF-1與CXCR4的結(jié)合后，ATV+ATV-MSCs對左心收縮和舒張功能的改善作用均被明顯抑制。組織學(xué)分析顯示，與MSCs組相比，ATV-MSCs和ATV+MSCs組的心肌纖維化面積顯著減小，炎細(xì)胞浸潤明顯減輕;ATV+ATV-MSCs組炎細(xì)胞浸潤進(jìn)一步減少，與ATV-MSCs組相比，纖維化面積顯著減小，上述作用可被AMD3100部分阻斷。蛋白芯

8、片結(jié)果顯示，在梗死周邊心肌組織中，與AMI組相比，ATV+ATV-MSCs組的炎癥因子IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α均下降最為顯著，抑炎因子IL-10水平明顯升高。ATV-MSCs和ATV+MSCs組歸巢到梗死周邊區(qū)心肌組織的MSCs數(shù)、新生動(dòng)脈數(shù)和毛細(xì)血管數(shù)均明顯高于MSCs組，心肌細(xì)胞的凋亡顯著少于MSCs組;ATV+ATV-MSCs組的歸巢MSCs數(shù)和新生毛細(xì)血管數(shù)與ATV-MSCs和ATV+MSCs組相比進(jìn)一步提高

9、，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)繼續(xù)顯著減少;上述指標(biāo)在給予AMD3100后均受到顯著抑制。與AMI組相比，移植MSCs組的心肌組織中內(nèi)源性c-Kit+干細(xì)胞數(shù)顯著增多，ATV+ATV-MSCs組進(jìn)一步提高了c-Kit+干細(xì)胞的數(shù)量，但并未顯著增加MSCs向心肌細(xì)胞的分化。
　　結(jié)論:ATV預(yù)處理或口服強(qiáng)化ATV均可以增強(qiáng)MSCs向梗死心肌的歸巢，二者聯(lián)合可通過SDF-1/CXCR4軸進(jìn)一步增加MSCs的歸巢和內(nèi)源性c-Kit+干細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)血

10、管新生，抑制心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，減少纖維化面積，提高心肌梗死后心功能?？诜?qiáng)化ATV聯(lián)合移植ATV預(yù)處理的MSCs可能成為提高干細(xì)胞療效的一有效方法。
　　第二部分：球形脂聯(lián)素降低缺氧無血清誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在惡劣的梗死微環(huán)境中的低存活率極大限制了其治療急性心肌梗死的療效。脂聯(lián)素(adiponectin，APN）是

11、一種脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，球形脂聯(lián)素(globular adiponectin，gAPN)是其C端球形結(jié)構(gòu)域，可以抗多種細(xì)胞凋亡，并具有干細(xì)胞調(diào)控特性。脂聯(lián)素主要通過與細(xì)胞表面的脂聯(lián)素受體1(AdipoR1)或受體2(AdipoR2)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用。單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是調(diào)控細(xì)胞能量代謝的核心分子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。因此我們在體外建立缺氧無血清(h

12、ypoxia and serum deprivation, H/SD)模型來模擬心肌梗死后體內(nèi)缺血缺氧的微環(huán)境，探討脂聯(lián)素能否減少M(fèi)SCs的凋亡，并明確發(fā)揮作用的受體和下游的信號通路。
　　方法:分離并培養(yǎng)34周齡雄性Sprague-Dawley大鼠骨髓MSCs，將第3代細(xì)胞隨機(jī)分為正常對照組、H/SD對照組、不同濃度梯度gAPN組(0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL)、通過小干擾RAN(small interfe

13、ring RNA，siRNA)干擾AdipoR1組、干擾AdipoR2組、干擾AdipoR1+AdipoR2組、AMPK通路抑制劑CompoundC組(10μM)。在熒光顯微鏡下觀察Hocchst33342染色陽性細(xì)胞，AnnexinⅤ/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡比例，Caspase-3活性試劑盒檢測Caspase-3活性;熒光探針JC-1染色檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MM

14、P)的變化，并進(jìn)一步采用Western blot方法檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2水平及AMPK及其磷酸化蛋白的水平。
　　結(jié)果:gAPN劑量依賴性的降低H/SD誘導(dǎo)的MSCs凋亡，表現(xiàn)為核皺縮和變性(Hocchst33342染色陽性)細(xì)胞減少，早期凋亡(AnnexinⅤ+/PI-)細(xì)胞和晚期凋亡(AnnexinⅤ+/PI+)細(xì)胞均呈劑量依賴性減少，Caspase-3活性降低，在1μg/mL濃度時(shí)最為明顯。

15、干擾AdipoR1的表達(dá)可明顯抑制gAPN的抗凋亡作用，而干擾AdipoR2的表達(dá)對gAPN的抗凋亡作用無顯著影響。gAPN各組AMPK的磷酸化水平升高，加入Compound C抑制AMPK的磷酸化后，gAPN的抗凋亡作用被顯著抑制。此外，gAPN升高抗凋亡蛋白Bcl-2、抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，抑制了線粒體膜電位的喪失，而干擾AdipoR1表達(dá)或加入Compound C后gAPN的上述作用被部分抑制。
　　結(jié)論:gAPN可以