單體尿酸鈉誘發(fā)的炎癥反應(yīng)中線粒體 DNA的表達(dá)及其意義的研究.pdf

1、目的：痛風(fēng)是一組由嘌呤代謝紊亂引起的以單鈉尿酸鹽(monomersodium urate，MSU)晶體沉積為特征的疾病。痛風(fēng)的急性發(fā)作是MSU在關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)外組織以結(jié)晶形式沉積引起的急性炎癥反應(yīng)。MUS作為誘發(fā)痛風(fēng)的始動(dòng)因素早已受到重視，但其導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的機(jī)理仍未完全明確，通過建立單鈉尿酸鹽晶體誘導(dǎo)的小鼠急性腹膜炎模型，大鼠急性關(guān)節(jié)炎模型，體外證實(shí)MSU誘導(dǎo)局部炎癥過程中相關(guān)炎癥因子IL-1β、IL-18的分泌，動(dòng)態(tài)觀察痛風(fēng)炎癥過程中，線

2、粒體DNA的表達(dá)與炎癥反應(yīng)的相關(guān)性。為臨床探索特異性干預(yù)策略提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：第一部分:將C57BL16雄性小鼠分2組;PBS對(duì)照組（腹腔注射0.2mlPBS）MSU組（腹腔注射0.2ml的15mg/ml的MSU）,分別在注射2h,4h,6h,8h,12h,16h,20h,24h后，取小鼠外周血，PBS灌洗腹腔取腹腔灌洗液，并取腹膜組織熒光免疫染色。采用ELISA檢測(cè)血漿、腹腔灌洗液中的炎癥因子IL-1β、IL-18水平，

3、提取DNA,熒光定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈法（Real-Time PCR）測(cè)定各組血漿、腹腔灌洗液中mtDNA表達(dá)量。并取小鼠腹膜組織病灶處制石蠟切片及腹腔灌洗液涂片，切片及細(xì)胞涂片均免疫熒光染色在熒光顯微鏡下觀察分析。
　　第二部分:選用雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組：PBS對(duì)照組，MSU組，MSU+DNASE1組及DNASE1組分別在大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)腔注入PBS，MSU，MSU+ DNASE1及DNASE1。注射后0,2,4,6,8,12,16

4、,20,24h觀察大鼠步態(tài)變化，測(cè)量足趾容積及踝關(guān)節(jié)直徑，周徑。并取造模后4h，8h，16h，20h，24h大鼠血漿，踝關(guān)節(jié)腔洗脫液檢測(cè)炎癥因子IL-1β，mtDNA復(fù)制水平及病理檢查。動(dòng)態(tài)觀察MSU誘導(dǎo)的炎癥過程中，mtDNA表達(dá)復(fù)制與炎癥的不同階段的相關(guān)性。
　　結(jié)果：第一部分，MSU急性腹膜炎小鼠的血漿、腹腔灌洗液中的炎癥因子IL-1β、IL-18水平在腹腔注射 MSU2h,4h后明顯升高，高于其他時(shí)間點(diǎn)及對(duì)照組（P均﹤0.

5、05）；MSU腹膜炎小鼠的血漿、腹腔灌洗液中線粒體DNA（mitochondrialDeoxyribonucleic acid，mtDNA）表達(dá)量給藥4h開始后升高，6h達(dá)峰值，8h開始下降，明顯高于其他時(shí)間點(diǎn)及對(duì)照組（P均﹤0.05）；對(duì)MSU腹膜炎小鼠的腹腔灌洗液涂片及腹膜組織進(jìn)行熒光免疫染色發(fā)現(xiàn)： MSU組給藥6小時(shí)后開始出現(xiàn)中性粒細(xì)胞的涌入，12h后開始出現(xiàn)中性粒細(xì)胞的聚集并在24h形成大量中性粒細(xì)胞的聚集即中性粒細(xì)胞外核酸網(wǎng)的

6、形成。
　　第二部分，大鼠急性關(guān)節(jié)炎模型中MSU組及MSU+DNASE1組均在2小時(shí)開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹，8小時(shí)達(dá)峰值，MSU組24小時(shí)后基本腫脹消退，功能恢復(fù)。MSU+DNASE1組緩解明顯遲于與MSU組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。MSU組及MSU+DNASE1組血漿，踝關(guān)節(jié)腔洗脫液炎癥因子IL-1β變化情況相似（P均>0.05）。造模后8小時(shí)，MSU組及MSU+DNASE1組血漿中均開始出現(xiàn)mtDNA的復(fù)制明顯，12小時(shí)均

7、達(dá)峰值，但MSU+DNASE1組血漿mtDNA的表達(dá)低于MSU組。關(guān)節(jié)灌洗液mtDNA的復(fù)制結(jié)果為4小時(shí)至8小時(shí)，PBS對(duì)照組，DNASE1組及MSU+DNASE1組無明顯差異均低于MSU組，MSU組在12小時(shí)達(dá)峰值后呈下降趨勢(shì)，而MSU+DNASE1組由12小時(shí)始輕度升高并在后面時(shí)間段內(nèi)呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢(shì)，但整體過程仍明顯底于MSU組（P均﹤0.05）。12小時(shí)病理檢查示：PBS對(duì)照組，DNASE1組無明顯炎癥表現(xiàn)，MSU+DNASE1組最