基于全基因表達(dá)譜早發(fā)和晚發(fā)子癇前期分子機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　子癇前期（Preeclampsia）是嚴(yán)重的妊娠期合并癥，是孕產(chǎn)婦發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一,約占全球孕產(chǎn)婦死亡的3％到5％。目前針對子癇前期尚無有效的治療措施，終止妊娠是唯一的治愈手段,因此，子癇前期成為導(dǎo)致早產(chǎn)的重要原因之一，增加了新生兒死亡率以及高額的醫(yī)療健康護(hù)理費(fèi)用。子癇前期對健康的影響不止局限于妊娠期，它也是遠(yuǎn)期心血管疾病的獨(dú)立危險因素。暴露于母體子癇前期的子代在其一生中患高血壓，糖尿病，中風(fēng)和精神疾患的風(fēng)

2、險遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常胎兒。在過去的30年間，關(guān)于子癇前期的發(fā)病機(jī)制和生理病理機(jī)制的研究不斷開展，以期尋找預(yù)測子癇前期的生物標(biāo)志物，治療途徑及其易感因素。
　　子癇前期根據(jù)疾病的輕重程度可劃分為輕度子癇前期和重度子癇前期，但是，此劃分標(biāo)準(zhǔn)沒有考慮孕周這個能夠預(yù)測孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒結(jié)局的重要臨床變量。在70年代末80年代初，大量專家學(xué)者通過發(fā)病孕周將子癇前期區(qū)分為早發(fā)子癇前期和晚發(fā)子癇前期。然而，兩者至今尚無統(tǒng)一的分界標(biāo)準(zhǔn)，多數(shù)學(xué)者將34周作為

3、分型界限，將早發(fā)子癇前期定義為發(fā)病孕周在34周之前的子癇前期，晚發(fā)子癇前期則在34周之后。盡管早發(fā)子癇前期和晚發(fā)子癇前期表現(xiàn)出一些重疊的臨床特點(diǎn)，但它們涉及不同的孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒的預(yù)后，生物標(biāo)志物，基因和環(huán)境危險因子，遺傳性和臨床特征。研究發(fā)現(xiàn)，早發(fā)子癇前期孕產(chǎn)婦死亡風(fēng)險明顯增加，32周前發(fā)生子癇前期的孕產(chǎn)婦死亡率是足月子癇前期的20倍。子癇前期使孕產(chǎn)婦因心血管疾病死亡的風(fēng)險增加7.1-8.1倍。同樣，依據(jù)嗜中性粒細(xì)胞功能和細(xì)胞因子水平的

4、研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)早發(fā)子癇前期與晚發(fā)子癇前期可能是性質(zhì)不同的兩種疾病。早發(fā)子癇前期更傾向于“胎源性疾病”，主要與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足，螺旋小動脈重塑障礙，胎盤灌注不良有關(guān)，從而導(dǎo)致胎兒生長受限，異常子宮和臍帶血流多普勒評估，低出生體重，多種器官紊亂，甚至圍產(chǎn)期死亡等更嚴(yán)重的母嬰結(jié)局。而晚發(fā)子癇前期被認(rèn)為是母體性疾病，與母體微血管疾病有關(guān)，例如慢性高血壓或者母體的遺傳傾向。通常涉及更大的胎盤血流量，正常的胎兒生長，正常的子宮和臍帶血管多普勒值，正常

5、的出生體重和更良好的母嬰結(jié)局。
　　微陣列技術(shù)，是融合電子學(xué)，計算機(jī)科學(xué)，生命科學(xué)及光電化學(xué)于一體的一項(xiàng)新興技術(shù)，借鑒了計算機(jī)芯片的原理，通過檢測固體表面已知序列的基因探針與被測的標(biāo)記后核酸序列相應(yīng)位置雜交探針，從而完成對基因信息的快速檢測。目前，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，基因芯片技術(shù)的開發(fā)，在研究基因表達(dá)譜分析，基因突變及多態(tài)性分析、基因組測序、發(fā)現(xiàn)新基因、基因芯片繪制圖譜等方面的廣泛運(yùn)用，使人們能夠快速、高效獲得大量基因表

6、達(dá)模式，分析調(diào)控過程，并從中篩選差異表達(dá)基因，從而打破了一種疾病一種基因的陳舊模式，解決了傳統(tǒng)方法中無法整體宏觀研究基因表達(dá)及功能等缺陷。
　　第一部分早發(fā)子癇前期和晚發(fā)子癇前期基因表達(dá)譜分析
　　目的：
　　采用基因芯片技術(shù)，研究早發(fā)子癇前期與晚發(fā)子癇前期胎盤基因表達(dá)譜的改變，篩選早發(fā)子癇前期和晚發(fā)子癇前期差異表達(dá)基因，從基因表達(dá)水平探討兩者發(fā)病的不同分子學(xué)機(jī)制，并為早發(fā)子癇前期及晚發(fā)子癇前期標(biāo)志物候選基因的篩選提供

7、依據(jù)。
　　方法：
　　1.試驗(yàn)對象：選取2014年2月至2015年3月在廣東省婦幼保健院分娩的婦女共25例，其中，早發(fā)子癇前期7例，晚發(fā)子癇前期8例，及與之孕周相對應(yīng)的早產(chǎn)對照組5例和正常對照組5例。早發(fā)子癇前期和晚發(fā)子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考衛(wèi)生部規(guī)劃全國高等學(xué)校教材婦產(chǎn)科學(xué)第8版。早產(chǎn)對照組中產(chǎn)婦均是由于宮頸機(jī)能不全或子宮畸形所致，不伴其他合并癥。以上均為單胎妊娠。
　　2.取樣：取得研究對象知情同意后，于胎盤娩出后

8、立即選擇母體面靠近中央臍帶周圍2cm處，在胎盤無鈣化，梗死和纖維蛋白沉積的區(qū)域剪取胎盤組織0.5cm×0.5cm×0.5cm各三份。使用0.9％無菌生理鹽水充分漂洗后立即浸泡于約1.0毫升的RNA保存液中，保存于-80℃待測。
　　3.全部標(biāo)本采用TotalRNAIsolation試劑盒（Takara）提取胎盤組織總RNA,操作步驟參考試劑盒說明書。使用NanoDrop2000分光光度計測定總RNA濃度，采取瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RN

9、A的質(zhì)量檢測。
　　4.使用PrimeScript?II1ststrandcDNASynthesis試劑盒（Takara）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并應(yīng)用LowInputQuickAmpLabeling試劑盒使用熒光染料Cy3和Cy5進(jìn)行標(biāo)記。cDNA純化后再次采取瓊脂糖凝膠電泳對RNA的完整性進(jìn)行評估。
　　5.使用Agilent公司生產(chǎn)的SurePrintG3HumanGE8x60Kv2MicroarrayChips，

10、GeneExpressionHybridization試劑盒，按照說明書步驟，使用雜交箱，芯片掃描儀進(jìn)行芯片雜交、洗滌與掃描。
　　6.微陣列數(shù)據(jù)通過美國安捷倫公司分析軟件（AgilentFeatureExtractionSoftware）提取，去除低密度的信號，使每個基因的80％以上的信號值＞800。使用Loessnormalization方法校正信號值。使用SAMv4.01software篩選差異表達(dá)基因（DEGs）,假陽性率

11、設(shè)置為5％(q-valueof<0.05)。篩選出倍數(shù)變化≥2或者q值小于0.05的基因作為差異表達(dá)基因。使用DAVIDv6.7軟件進(jìn)行富集分析，并將DR≤0.05視為具有統(tǒng)計學(xué)差異，確定這些基因富集的生物學(xué)通路。
　　7.選擇其中顯著差異表達(dá)基因中的11個使用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）進(jìn)行驗(yàn)證。使用7500real-timePCRsystem（AppliedBiosystems）和SYBRGreenRealtimePC

12、RMaterMix（Takara）進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。每個PCR反應(yīng)均設(shè)置三個復(fù)孔，使用glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase(GAPDH)作為內(nèi)參。
　　8.使用蛋白免疫印跡法(Westernblotting)對其中2個分泌基因從蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　1.四組產(chǎn)婦在年齡，產(chǎn)前體重指數(shù)均沒有顯著差異，早發(fā)子癇前期組與晚發(fā)子癇前期組的收縮壓和舒張壓沒有統(tǒng)計學(xué)差異，子

13、癇前期組的胎盤和新生兒體重明顯低于其對照組，而子癇前期組的平均孕周與其對照組均無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2．非監(jiān)督聚類分析顯示，早發(fā)子癇前期組明顯聚類在一起，而晚發(fā)子癇前組中一部分與對照組交叉，早產(chǎn)對照組與正常對照組聚類在一起無法區(qū)分。
　　3.在早產(chǎn)對照組與正常對照組比較中，未發(fā)現(xiàn)明顯差異表達(dá)基因。有627個基因在早發(fā)子癇前期相較晚發(fā)子癇前期差異表達(dá)，其中，177個基因在早發(fā)子癇前期表達(dá)上調(diào)，450個基因在早發(fā)子癇前期表達(dá)下調(diào)。

14、GO分析顯示差異表達(dá)基因在免疫炎癥反應(yīng)，細(xì)胞表面受體相關(guān)信號傳導(dǎo)，細(xì)胞粘附，母體妊娠和血管生成等生物途徑顯著富集。
　　4.qRT-PCR顯示GREM2(P＜0.01),LEP(P＜0.01),PSG11(P＜0.05),SIGLEC6(P＜0.01),ANG2(P＜0.01)在早發(fā)子癇前期相對晚發(fā)子癇前期顯著增高。而GPR124(P＜0.01),MRGPRF(P＜0.02),HLA-B(P＜0.0085),S100A8(P＜0.

15、01),PLA2G7(P＜0.01),TNFSF10(P＜0.01)和AOC3(P＜0.05)在早發(fā)子癇前期相對晚發(fā)子癇前期顯著降低。
　　5.Westernblotting顯示GREM2分泌蛋白水平(P＜0.05)在早發(fā)子癇前期胎盤組織中相較晚發(fā)子癇前期顯著增高，而GPR124分泌蛋白水平(P＜0.05)在早發(fā)子癇前期胎盤組織相較晚發(fā)子癇前顯著降低。
　　結(jié)論：
　　1.根據(jù)非監(jiān)督聚類分析顯示，早發(fā)子癇前期主要起源于

16、胎盤，而晚發(fā)子癇前期更傾向于母體性疾病，通常涉及較輕的胎盤改變。
　　2.通過對早產(chǎn)對照組及正常對照組差異表達(dá)基因的分析，發(fā)現(xiàn)妊娠晚期胎盤的基因表達(dá)受孕周影響較少。
　　3.早發(fā)子癇前與晚發(fā)子癇前期基因表達(dá)譜不同表明兩者具有不同的分子學(xué)機(jī)制，涉及免疫炎癥反應(yīng)，細(xì)胞表面受體相關(guān)信號傳導(dǎo)，細(xì)胞粘附，母體妊娠和血管生成等生物途徑，支持早發(fā)子癇前期與晚發(fā)子癇前期可能是兩種疾病這一推斷。
　　4.篩選出的部分基因可作為早發(fā)子癇前

17、期發(fā)生機(jī)制和早期分子診斷的候選基因，有待于進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證和深入研究。
　　第二部分早發(fā)和晚發(fā)子癇前期血清分泌蛋白的檢測
　　目的：
　　檢測早發(fā)子癇前期和晚發(fā)子癇前期患者血清中ANG2，GREM2，PSG3及PSG11水平，探討其與子癇前期發(fā)病機(jī)制的關(guān)系及對子癇前期的診斷價值，尋找有可能成為預(yù)測、診斷和治療子癇前期的分子標(biāo)志物。
　　方法：
　　1.試驗(yàn)對象：取2014年2月至2015年3月與廣東省婦幼保健

18、院分娩的妊娠婦女150例進(jìn)行分組，包括早發(fā)子癇前期組50例，晚發(fā)子癇前期組50例及與其年齡，孕周相匹配的無伴妊娠期合并癥的正常對照組50例。
　　2.取樣：所有研究對象均于入院未進(jìn)行任何處理抽取肘靜脈血，使用抗凝管3支，每支4ml。使用低溫高速離心機(jī)在-4℃下采取2500r/min，離心10分鐘。留取上清液，置于無菌EP管中，放于-80℃低溫冰箱保存。
　　3.使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒，嚴(yán)格按照說明書步驟，測

19、定血清ANG2，GREM2，PSG3，PSG11蛋白OD值，并計算蛋白濃度。比較早發(fā)子癇前期和晚發(fā)子癇前期蛋白標(biāo)志物水平的差異。
　　4.繪制受試者工作曲線，計算分子標(biāo)志物診斷子癇前期的靈敏度和特異度。
　　結(jié)果：
　　1、孕婦血清ANG-2水平在早發(fā)子癇前期和晚發(fā)子癇前期沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）,早發(fā)子癇前期和晚發(fā)子癇前期的ANG2水平均高于正常對照組。血清ANG2水平在截斷值為12.04ng/mL診斷子癇前期

20、的靈敏度為71％，特異度為87％。
　　2、孕婦血清GREM2水平在早發(fā)子癇前期和晚發(fā)子癇前期沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），早發(fā)子癇前期和晚發(fā)子癇前期組的GREM2水平均低于正常對照組。血清GREM2水平在截斷值為488.9pg/mL診斷子癇前期的靈敏度為69.23％，特異度為80％
　　3、孕婦血清PSG3和PSG11水平在早發(fā)子癇前期，晚發(fā)子癇前期及正常對照組沒有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：

21、>　　1、孕婦血清ANG2水平在子癇前期患者中相對于正常產(chǎn)婦高表達(dá)，ANG2升高對子癇前期的發(fā)生和發(fā)展可能起促進(jìn)作用。
　　2、孕婦血清GREM2水平在子癇前期患者中相對于正常產(chǎn)婦明顯降低，GREM2降低可能與子癇前期的發(fā)生有關(guān)。
　　3、血清ANG2≥12.04ng/mL，GREM2≤488.9pg/mL對子癇前期具有診斷意義。
　　4、PSG3和PSG11在母體血清中的水平受多種因素影響，在子癇前期與正常產(chǎn)婦沒有差