睪酮對(duì)青春期雄鼠糖脂代謝,血管損傷的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　通過分子生物學(xué)方法，觀察睪酮對(duì)青春期雄性大鼠糖脂代謝以及動(dòng)脈損傷的影響，并以原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）為研究對(duì)象，利用LPS制造血管內(nèi)皮損傷模型，探討含睪酮培養(yǎng)液對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞是否具有保護(hù)作用并基于PI3K信號(hào)通路探討睪酮發(fā)揮作用的可能機(jī)制。
　　方法：
　　將21日齡SD雄性大鼠40只，(動(dòng)物房保持12小時(shí)光照與黑暗的循環(huán)交替，每天7：30給予照明)斷奶適應(yīng)性飼養(yǎng)1天后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（no

2、rmal control group，NC），高脂組（high fat diet，F(xiàn)C），高脂+低劑量睪酮補(bǔ)充組（high fat diet+low dose testosterone，F(xiàn)LT）以及高脂+高劑量睪酮補(bǔ)充組（high fat diet+high dose testosterone，F(xiàn)HT），每組各10只。正常對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，其他實(shí)驗(yàn)組均以高脂飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)3周后，以高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠體重超過正常對(duì)照組大鼠體重20％

3、的定為成功造模的肥胖大鼠模型，其余未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)的鼠棄去。各組大鼠均為42日齡(即青春期開始），F(xiàn)C組每日給予過濾除菌的花生油皮下注射，睪酮融于花生油中，制備成12.5ug/kg以及25ug/kg溶劑，F(xiàn)LT組每日給予12.5ug/kg睪酮皮下注射，F(xiàn)HT組每日給予25ug/kg睪酮皮下注射。給藥共4周，期間各組大鼠均按原飼料喂養(yǎng)。生長至10周末，分別測量大鼠體重，禁食12小時(shí)后取內(nèi)眥靜脈血監(jiān)測空腹血糖（Fasting blood gluco

4、se，F(xiàn)PG）、空腹胰島素（Fasting insulin，F(xiàn)INS）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白（High-density lipoprotein，HDL）、睪酮（Testosterone，T）、雌二醇（Estradiol，E2），計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）與非高密度脂蛋白（Non-high density lipoprotein，non-HDL）。取血后將各組大鼠處死，取各組大鼠腹主

5、動(dòng)脈，利用HE染色的方法觀察各組大鼠腹主動(dòng)脈的病理形態(tài)改變有無差別，采用免疫組化、western blot、PCR方法檢測PI3K、IRS-1、AKT、GLUT-4、NF-κB、TNF-α在各組大鼠動(dòng)脈壁中的表達(dá)含量。利用Tunel染色比較各組大鼠動(dòng)脈壁細(xì)胞凋亡情況。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較各指標(biāo)在四組大鼠中的表達(dá)是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并對(duì)睪酮濃度與各個(gè)生化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，根據(jù)r值大小明確睪酮與各個(gè)指標(biāo)之間的相關(guān)程度。1mg/ml的II型

6、膠原酶灌注消化法分離提取HUVEC細(xì)胞。達(dá)到80%以上貼壁融合后傳代培養(yǎng)并鑒定，采用6代以內(nèi)HUVECs用于以下實(shí)驗(yàn)。分別以濃度為0 ug/ml、1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml含LPS培養(yǎng)液刺激6 h、12 h和24 h后，用MTT法比較各組HUVECs的增殖情況，根據(jù)結(jié)果選擇合適的LPS刺激濃度，建立細(xì)胞損傷模型。再采用六種梯度濃度的睪酮培養(yǎng)液，分為LPS+10-6mol/lT組，LPS+10-7mol/l T組，LP

7、S+10-8mol/lT組，LPS+10-9mol/l T組，LPS+10-10mol/lT組和LPS+10-11mol/l T組，處理細(xì)胞，進(jìn)行MTT、Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果選擇最佳含睪酮培養(yǎng)液的濃度。以下實(shí)驗(yàn)選擇最佳濃度的LPS和含睪酮培養(yǎng)液，將細(xì)胞隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組（control組）、LPS模型組和LPS+最佳濃度睪酮組。應(yīng)用TUNEL試劑盒檢測各組細(xì)胞凋亡情況，利用免疫熒光、wester

8、n和PCR技術(shù)檢測各組細(xì)胞內(nèi)PI3K信號(hào)通路中各指標(biāo)的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.FC組大鼠體型較NC組明顯肥碩;FC組大鼠體重與NC組大鼠相比差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,青春期肥胖大鼠造模成功(P<0.05)。FC組大鼠空腹血糖、胰島素、HOMA-IR、TC、non-HDL、E2顯著高于NC組(P<0.05)，HDL、T顯著低于NC組(P<0.05)，F(xiàn)LT組大鼠空腹血糖、胰島素、HOMA-IR、TC、non-HDL、E2顯著

9、低于FC組(P<0.05)，F(xiàn)LT組大鼠HDL、T顯著高于FC組(P<0.05)。FHT組大鼠空腹血糖、胰島素、HOMA-IR、TC、non-HDL、E2顯著高于NC組(P<0.05)，F(xiàn)HT組大鼠空HDL、T顯著高于NC組(P<0.05)。
　　2.HE染色顯示：NC組大鼠血管內(nèi)皮和外膜邊界清晰，內(nèi)彈性模完整，血管壁薄厚均勻，血管各層細(xì)胞排列整齊；FC組與FHT組大鼠血管內(nèi)膜外膜邊界欠清，細(xì)胞各層細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核極性差；FL

10、T組大鼠血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整，各層細(xì)胞排列整齊。
　　3.免疫組化、western blot、PCR結(jié)果顯示FC組、FHT組PI3K、NF-κB與TNF-α的表達(dá)量明顯高于NC組（P<0.05）,AKT、IRS-1與GLUT-4的表達(dá)量明顯低于NC組（P<0.05）；FLT組PI3K、NF-κB與TNF-α的表達(dá)量明顯低于FC組（P<0.05）,AKT、 IRS-1與GLUT-4的表達(dá)量明顯高于FC組（P<0.05）。
　　4.

11、相關(guān)分析顯示：NC組、FC組與FLT組FPG、FINS、HOMA-IR、TC、non-HDL隨睪酮的升高而下降，HDL隨睪酮的升高而升高；FHT組FPG、FINS、HOMA-IR、TC、non-HDL隨睪酮升高而升高，HDL隨睪酮升高而下降。
　　5.成功提取并培養(yǎng)HUVEC原代細(xì)胞，利用兔抗人VIII因子抗體進(jìn)行免疫組化染色鑒定，結(jié)果均為陽性表達(dá)。
　　6.MTT結(jié)果顯示10ug/ml濃度LPS作用6小時(shí)可以使細(xì)胞生長受到

12、抑制，與正常對(duì)照組相比具有顯著性差異（P<0.05）,以10ug/ml濃度LPS作用6小時(shí)制備內(nèi)管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。
　　7.MTT法、Transwell小室以及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明，生理濃度睪酮培養(yǎng)液，即10-9mol/l睪酮培養(yǎng)液可以顯著改善LPS導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性以及遷移能力的下降（P<0.05）。在達(dá)到生理濃度之前，睪酮對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性以及遷移能力的作用隨濃度升高而提升，高于生理濃度時(shí)睪酮對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性以及遷移能力的

13、作用隨濃度升高而下降（P<0.05）。
　　8.TUNEL染色顯示 LPS模型組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05），LPS+10-9mol/l睪酮培養(yǎng)液組細(xì)胞凋亡指數(shù)亦高于正常對(duì)照組，但顯著低于LPS模型組（P<0.05）。
　　9.細(xì)胞免疫熒光顯示，與正常對(duì)照組相比較，LPS模型組與LPS+生理睪酮處理組的細(xì)胞內(nèi)GLUT-4熒光強(qiáng)度表達(dá)顯著下降，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）；與LPS模型組比較，生理濃度

14、睪酮處理組的HUVECs細(xì)胞內(nèi)GLUT-4熒光強(qiáng)度表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與正常對(duì)照組相比較，LPS模型組與生理睪酮處理組的細(xì)胞內(nèi)NF-κB熒光強(qiáng)度表達(dá)顯著升高，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與LPS模型組比較，生理濃度睪酮處理組的HUVECs細(xì)胞內(nèi)NF-κB熒光強(qiáng)度表達(dá)顯著下降（P<0.001）。
　　10.western blot、PCR結(jié)果顯示IRS-1、AKT和GLUT-4在正常對(duì)照組中表達(dá)豐富，在LPS模

15、型組中的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05），在LPS+生理濃度睪酮組中的表達(dá)較LPS模型組明顯增加（P﹤0.05）。NF-κB、PI3K和TNF-α蛋白在正常對(duì)照組中表達(dá)不豐富，在LPS模型組中的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05），在LPS+生理濃度睪酮組中的表達(dá)較LPS模型組明顯降低（P﹤0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.斷乳21天幼鼠連續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)3周，青春期肥胖大鼠

16、模型可成功建立。高脂飲食喂養(yǎng)青春期大鼠可以引起睪酮水平下降、糖代謝異常、血脂紊亂、動(dòng)脈壁呈損傷性病理改變。
　　2.外源性生理劑量睪酮可以減輕高脂飲食造成的糖代謝異常、血脂紊亂、動(dòng)脈壁病理損傷性改變；外源性高劑量睪酮會(huì)進(jìn)一步加重糖代謝異常、血脂紊亂、動(dòng)脈壁病理結(jié)構(gòu)改變，說明外源性睪酮對(duì)肥胖青春期大鼠的作用有劑量依賴性。
　　3.外源性睪酮對(duì)糖脂代謝以及動(dòng)脈壁形態(tài)的作用可由PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)。
　　4.生理濃度

17、含睪酮培養(yǎng)液可以有效改善LPS導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性降低、遷移能力下降以及凋亡指數(shù)增加等損害。
　　5.睪酮對(duì)LPS刺激的HUVEC的保護(hù)作用在低于生理濃度時(shí)，存在濃度依賴作用；高于生理濃度時(shí)，睪酮的保護(hù)作用隨濃度的增加而下降。
　　6.睪酮對(duì)LPS刺激的HUVEC保護(hù)作用的機(jī)制與抑制NF-κB、PI3K和TNF-α表達(dá)，增加IRS-1、AKT和GLUT-4的表達(dá)有關(guān)。PI3K/AKT信號(hào)通路是睪酮保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的可能途徑