腎康注射液指紋圖譜與藥動學(xué)研究.pdf

1、腎康注射液是由大黃、黃芪、丹參和紅花四味中藥水提精制成的中藥復(fù)方注射劑，主要用于治療慢性腎功能衰竭證屬濕濁血瘀。由于該方成分復(fù)雜，前期研究未建立該制劑藥效物質(zhì)的含量測定方法，因此，建立同時測定腎康注射液中9種化合物（沒食子酸、丹參素鈉、原兒茶醛毛蕊異黃酮葡萄糖苷、迷迭香酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素及大黃酚)含量的HPLC-UV方法，以及檢測羥基紅花黃色素A的LC-MS/MS方法，將該方法用于15個不同批次的含量測定，方法穩(wěn)定可靠，為制

2、定腎康注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了重要參考依據(jù)。
　　到目前為止，沒有文獻報道腎康注射液有效成分的體內(nèi)藥動學(xué)特征。本課題采用LC-MS/MS法對大鼠血漿中的大黃酸、大黃素、迷迭香酸、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A和毛蕊異黃酮葡萄糖苷進行濃度測定，并開展體內(nèi)藥動學(xué)研究。
　　本文主要從以下幾方面進行了論述：
　　1.腎康注射液指紋圖譜的建立及含量測定
　　目的：建立同時測定腎康注射液中9種化合物（沒食子酸、丹參素鈉、原兒茶醛

3、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、迷迭香酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素及大黃酚）含量的HPLC-UV
　　方法：HPLC-UV測定方法，色譜柱:DikmaInspire-C18 column(150×4.6mm，5μm):流動相:乙腈(A)-水（1％冰醋酸）(B)，A相的含量隨時間變化為8％～10％(0～10min)、10％～17％(10～20min)、17％～20％(30～65 min)、30％～80％(65～110min);流速:1.0ml

4、/min,檢測波長:280nm，柱溫:30℃。LC-MS/MS測定羥基紅花黃色素A的檢測條件:色譜柱:Phenomenex-C18column(150×4.6mm，4m);流動相:甲醇:水(15 mmol·L-1醋酸銨，0.02％甲酸)=85∶15(v/v)，流速:0.5ml/min;柱溫:40℃;運行時間6min。離子檢測方式:MRM;離子極性:負離子(Negative);檢測對象:羥基紅花黃色素Am/z611.2→491.2，裂解電

5、壓:230V;碰撞能:25eV;雙氯芬酸鈉(內(nèi)標(biāo)物)m/z294→250，裂解電壓:80V;碰撞量:4eV。
　　結(jié)果：HPLC-UV測定9種化合物，沒食子酸、丹參素鈉、原兒茶醛、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、迷迭香酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素及大黃酚，在110min內(nèi)基線分離，其質(zhì)量濃度分別在104-1260μg/ml、132.1-1981.5μg/ml、10.56-31.66μg/ml、3.29-17μg/ml、2.02-15.57μ

6、g/ml、1.16-3.7μg/ml、2.25-19.64μg/ml、0.12-1.61μg/ml、0.12-1.41μg/ml內(nèi)線性關(guān)系良好，R2分別為0.999、0.998、0.999、0.999、0.996、0.999、0.995、0.999、0.999。平均加樣回收率在96.88％～105.74％，RSD均低于7.2％。LC-MS/MS法測定羥基紅花黃色素A，在20 min內(nèi)基線分離，濃度0.02-1.01μg/ml內(nèi)線性關(guān)系良

7、好，R2=0.997，平均加樣回收率在99.68％～102.01％，RSD低于3.2％。
　　結(jié)論：該方法可用于腎康注射液中化合物的含量測定;不同批次制劑含量有顯著差異。
　　2.大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究
　　目的：本試驗研究旨在建立同時測定靜脈注射腎康注射液后大鼠血漿中大黃酸、大黃素、迷迭香酸、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的藥物濃度，并開展體內(nèi)藥動學(xué)研究。
　　方法：采用LC-MS/MS方法，色譜

8、柱:Phenomenex-C18column(150×4.6mm，4μm)。同時測定大黃酸、大黃素、迷迭香酸的檢測條件:流動相:乙腈:水(10mmol/L醋酸銨，0.04％甲酸)=84∶16(v/v)，流速:0.5 ml/min;柱溫:40℃;運行時間:5min。質(zhì)譜條件:離子檢測方式:MRM;離子極性:負離子(Negative);檢測對象:大黃酸m/z283.1→239.1，裂解電壓:70V，碰撞能:7eV;大黃素m/z269.1→2

9、25，裂解電壓:130V，碰撞能:27eV;迷迭香酸m/z358.8→161，裂解電壓:90V，碰撞能:12eV;雙氯芬酸鈉(內(nèi)標(biāo)物)m/z294→250，裂解電壓:80V，碰撞能:4eV。測定原兒茶醛的檢測條件:流動相:甲醇:水(0.04％甲酸)=87∶13(v/v)，流速:0.5ml/min;柱溫:40℃;運行時間:6min。離子檢測方式:MRM;離子極性:負離子(Negative);檢測對象:原兒茶醛m/z137→108、裂解電壓

10、:100V;碰撞能:23eV;雙氯芬酸鈉(內(nèi)標(biāo)物)m/z294→250，裂解電壓:80V，碰撞能:4eV。測定羥基紅花黃色素A的檢測條件:流動相:甲醇:水(15mmol· L-1醋酸銨，0.02％甲酸)=85∶15(v/v)，流速:0.5ml/min;柱溫:40℃;運行時間6min。離子檢測方式:MRM;離子極性:負離子(Negative);檢測對象:羥基紅花黃色素Am/z611.2→491.2，裂解電壓:230V;碰撞能:25eV;雙

11、氯芬酸鈉(內(nèi)標(biāo)物)m/z294→250，裂解電壓:80V;碰撞量:4eV。測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷的檢測條件:流動相:乙腈:水(15mmol/L醋酸銨，0.02％甲酸)=85∶15(v/v)，流速:0.4ml/min;柱溫:40℃;運行時間:5min。離子檢測方式:MRM;離子極性:正離子(Positive);檢測對象:毛蕊異黃酮葡萄糖苷m/z447→285，裂解電壓:120V，碰撞能:10eV;酮洛芬(內(nèi)標(biāo)物)m/z255→209，裂解

12、電壓:80V，碰撞能:8eV。
　　結(jié)果：大黃酸在25.15-2515.0ng/ml、大黃素在2.01-1004.5ng/ml、迷迭香酸在9.98ng/ml～4990ng/ml、原兒茶醛在0.5ng/ml～100.2ng/ml、羥基紅花黃色素A在5.04ng/ml～1007.0ng/ml、毛蕊異黃酮葡萄糖苷在1.004ng/ml～301.2ng/ml內(nèi)線性關(guān)系良好。最低定量限(LLOQ)分別為25.15ng、2.01ng、9.98