VPA及其代謝產(chǎn)物血藥濃度RP-HPLC分析方法建立及與CYP2C9-3相關(guān)性的初探.pdf

1、目的：建立同時(shí)測定丙戊酸鈉(Sodium Valproate，VPA)及其代謝產(chǎn)物2-ene-VPA(2-Propyl-2-pentenoic Acid,2-ene-VPA)和4-ene-VPA(2-Propyl-4-pente-noic Acid,4-ene-VPA)血藥濃度的反相高效液相色譜法(Reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)，分析服藥劑量與

2、 VPA、2-ene-VPA和4-ene-VPA血藥濃度的關(guān)系，探討性別對VPA、2-ene-VPA和4-ene-VPA血藥濃度的影響，細(xì)胞色素 P4502C9(CYP2C9)基因多態(tài)性與 VPA和4-ene-VPA血藥濃度的關(guān)系，為丙戊酸鈉個(gè)體化用藥提供參考。
　　方法：選擇確診為癲癇且單藥服用丙戊酸鈉治療，無肝功能異常和器質(zhì)性病變的18歲以下癲癇患者，每天定時(shí)服用VPA，血藥濃度達(dá)穩(wěn)態(tài)后，于清晨服藥前抽取患者靜脈血2 mL進(jìn)行

3、以下檢測：(1)建立反相高效液相色譜法測定丙戊酸鈉與2-ene-VPA和4-ene-VPA的血藥濃度。血漿以正辛酸為內(nèi)標(biāo)，用硫酸酸化，正己烷提取，氮?dú)鈸]干樣品，乙腈復(fù)溶，2,4'-二溴苯乙酮作為衍生化試劑，三乙胺催化，在80℃水浴衍生化30 min；色譜柱：ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm,5μm)，紫外檢測波長：258 nm，流動相：乙腈-甲醇-水＝59:13:28，流速：1.0 mL?min-1，柱溫：35℃

4、；(2)用血液直接 PCR方法檢測74名患兒 CYP2C9基因型；(3)分析VPA服藥劑量、性別對VPA、2-ene-VPA及4-ene-VPA血藥濃度的影響，CYP2C9基因型與 VPA及4-ene-VPA血藥濃度的關(guān)系；(4)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：計(jì)量資料用-χ±S表示，運(yùn)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對 VPA服藥劑量與 VPA、2-ene-VPA及4-ene-VPA血藥濃度之間的關(guān)系，VPA血藥濃度與2-ene-VPA和4-ene-VPA血藥

5、濃度之間的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)探討性別對VPA、2-ene-VPA和4-ene-VPA血藥濃度的影響，CYP2C9基因型與 VPA和4-ene-VPA血藥濃度的關(guān)系。
　　結(jié)果：(1)VPA、2-ene-VPA及4-ene-VPA的RP-HPLC分析方法：VPA、2-ene-VPA、4-ene-VPA和內(nèi)標(biāo)正辛酸的保留時(shí)間分別為11.6 min、9.4 min、8.6 min和12.4 min；VPA、2-ene

6、-VPA和4-ene-VPA與內(nèi)標(biāo)正辛酸的峰面積比與濃度呈良好的線性關(guān)系，VPA濃度范圍為5.00~200.00μg?mL-1，yVPA=0.2169 xVPA＋0.6286(r=0.9995，n=5);2-ene-VPA濃度范圍為0.50~16.00μg?mL-1，y2-ene-VPA=0.3206 x2-ene-VPA＋0.1041(r=0.9991，n=5)；4-ene-VPA濃度范圍為0.50~16.00μg?mL-1，y4-e

7、ne-VPA=0.4357 x4-ene-VPA＋0.3531(r=0.9996，n=5)，最低定量限分別為5.00μg?mL-1，0.50μg?mL-1和0.50μg?mL-1(S/N>5)；VPA、2-ene-VPA和4-ene-VPA低、中、高3個(gè)濃度血漿質(zhì)控樣品的平均提取回收率分別為 VPA74.60%、81.44%、81.97%，2-ene-VPA76.82%、83.26%、78.57%，4-ene-VPA79.46%、83.

8、26%、79.36%，日內(nèi) RSD<5%，日間RSD<5%，穩(wěn)定性RSD<5%；(2) CYP2C9目的基因條帶大小為315 bp，野生型CYP2C9*1和突變型 CYP2C9*3等位基因頻率分別為95.25%和4.75%，野生型純合子(CYP2C9*1/*1)和突變型雜合子(CYP2C9*1/*3)基因型頻率分別為90.5%和9.5%；(3)納入0~17歲的癲癇患兒74例，平均年齡(6.5±4.1)歲，VPA平均給藥劑量(18.34±

9、5.86) mg?kg-1；(4)VPA給藥劑量與VPA、2-ene-VPA和4-ene-VPA血藥濃度之間的關(guān)系：VPA給藥劑量與 VPA血藥濃度相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，R=0.330)，與2-ene-VPA、4-ene-VPA血藥濃度相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.175，R=0.160)，(P=0.131，R=0.186);(5)性別對 VPA、2-ene-VPA和4-ene-VPA血藥濃度的影響：①服用VPA的74例癲癇

10、患兒中，男性與女性VPA給藥劑量分別為(18.01±5.58) mg?kg-1和(19.02±6.18) mg?kg-1，二組間給藥劑量差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.505)，②癲癇患兒 VPA、2-ene-VPA、4-ene-VPA血藥濃度分別為男性(70.15±24.79)μg?mL-1、(3.56±1.51)μg?mL-1、(1.07±0.40)μg?mL-1,女性(76.23±23.61)μg?mL-1、(3.39±1.70)μ

11、g?mL-1、(1.08±0.39)μg?mL-1,男女之間血藥濃度相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.346)，(P=0.682)，(P=0.970)；(6)基因型對 VPA和4-ene-VPA血藥濃度的影響：① A組(CYP2C9*1/*1)和 B組(CYP2C9*1/*3)給藥劑量分別為(17.89±5.66) mg?kg-1和(22.12±5.15) mg?kg-1，兩組給藥劑量差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.062)；②A組和B組

12、VPA血藥濃度分別為(70.94±25.28)μg?mL-1和(79.93±12.94)μg?mL-1，兩組血藥濃度差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.359)；③4-ene-VPA血藥濃度分別為(1.11±0.39)μg?mL-1和(0.76±0.29)μg?mL-1，兩組血藥濃度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025)。
　　結(jié)論：(1)本課題建立了同時(shí)測定VPA及其代謝產(chǎn)物2-ene-VPA和4-ene-VPA血藥濃度的RP-HPLC