離子對(duì)RP-HPLC檳榔堿測(cè)定方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、目的：通過(guò)建立離子對(duì)反相高效液相色譜檢測(cè)檳榔堿的方法，為全面評(píng)價(jià)檳榔堿的毒性作用與機(jī)制、劑量-效應(yīng)關(guān)系、以及代謝動(dòng)力學(xué)等方面研究提供實(shí)驗(yàn)手段。 方法：采用日本島津高效液相色譜儀（LCSOLUTIN工作站），以0.1％SDS（含0.1％三乙胺，磷酸調(diào)pH至2.5～2.6）與乙腈為流動(dòng)相檢測(cè)肝勻漿、檳榔殼檳榔堿的含量，以及檳榔堿體外代謝的速率；采用MTT法與形態(tài)學(xué)觀察評(píng)價(jià)檳榔堿的細(xì)胞毒性作用；通過(guò)50℃熱處理肝S9或不加NADPH等

2、干預(yù)措施，探討微粒體酶與FMO對(duì)檳榔的代謝以及對(duì)檳榔堿誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用的影響。 結(jié)果：離子對(duì)RP-HPLC法檢測(cè)檳榔堿的最低檢測(cè)限度為1ng，理論踏板數(shù)為15961±276，在1～40ng的劑量范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。以10％的高氯酸提取肝組織勻漿檳榔堿，氨水堿化后乙醚萃取是一種較好的肝勻漿樣品的處理過(guò)程，樣品的最低檢出限度為50ng/ml。2％鹽酸能有效的提取檳榔中的檳榔堿，重復(fù)2次提取后提取率達(dá)99％以上，

3、2％的檳榔鹽酸提取液可直接用于檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單、方便。在含肝S9或50℃熱處理的肝S9的體外代謝體系中，不論加與不加NADPH，檳榔堿均被迅速代謝，各反應(yīng)體系代謝檳榔堿的能力無(wú)明顯差別，半代謝期大約為60～70min。50μg/ml的檳榔堿具有明顯的細(xì)胞毒性，影響L-02肝細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，以及對(duì)MTT的代謝能力，檳榔堿誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有明顯的劑量依賴(lài)性。與單純檳榔堿處理組比較，肝S9預(yù)處理不論從細(xì)胞形態(tài)，還是從細(xì)胞MTT的代謝能力等方面均

4、提示肝S9在一定的程度上能保護(hù)細(xì)胞免除檳榔堿的毒性。經(jīng)肝S9處理后，L-02細(xì)胞可耐受300μg/ml檳榔堿的毒性作用。50℃熱處理1min后，肝S9仍具有相同的保護(hù)作用，與未處理的肝S9比較無(wú)明顯差別。 結(jié)論： 1.離子對(duì)RP-HPLC法檳榔堿測(cè)定的敏感性高、重現(xiàn)性好，是微量檳榔堿檢測(cè)的較理想的方法。通過(guò)改變洗脫液的組成，可用于肝勻漿、檳榔中檳榔堿的測(cè)定。 2.肝勻漿組分具有較強(qiáng)的代謝檳榔堿的能力，代謝率隨時(shí)間

5、變化呈指數(shù)增加，擬合的非線性回歸方程式為y=98.97e-0.0110X，微粒體酶、FMO對(duì)檳榔堿的代謝作用不明顯。 3.檳榔堿具有一定的細(xì)胞毒性，50μg/ml的檳榔堿對(duì)L-02肝細(xì)胞具有一定的毒性作用，檳榔堿誘導(dǎo)的L-02肝細(xì)胞毒性作用具有明顯的劑量依賴(lài)性。 4.肝S9能保護(hù)L-02肝細(xì)胞免除檳榔堿的毒性，0.05mg/ml的肝S9幾乎完全阻斷了300μg/ml檳榔堿的毒性作用，而微粒體酶、FMO在檳榔堿的代謝解毒過(guò)