離子對RP-HPLC檳榔堿測定方法的建立與應用.pdf

1、目的：通過建立離子對反相高效液相色譜檢測檳榔堿的方法，為全面評價檳榔堿的毒性作用與機制、劑量-效應關系、以及代謝動力學等方面研究提供實驗手段。 方法：采用日本島津高效液相色譜儀（LCSOLUTIN工作站），以0.1％SDS（含0.1％三乙胺，磷酸調(diào)pH至2.5～2.6）與乙腈為流動相檢測肝勻漿、檳榔殼檳榔堿的含量，以及檳榔堿體外代謝的速率；采用MTT法與形態(tài)學觀察評價檳榔堿的細胞毒性作用；通過50℃熱處理肝S9或不加NADPH等

2、干預措施，探討微粒體酶與FMO對檳榔的代謝以及對檳榔堿誘導的細胞毒性作用的影響。 結(jié)果：離子對RP-HPLC法檢測檳榔堿的最低檢測限度為1ng，理論踏板數(shù)為15961±276，在1～40ng的劑量范圍內(nèi)，進樣量與峰面積呈良好的線性關系。以10％的高氯酸提取肝組織勻漿檳榔堿，氨水堿化后乙醚萃取是一種較好的肝勻漿樣品的處理過程，樣品的最低檢出限度為50ng/ml。2％鹽酸能有效的提取檳榔中的檳榔堿，重復2次提取后提取率達99％以上，

3、2％的檳榔鹽酸提取液可直接用于檢測，操作簡單、方便。在含肝S9或50℃熱處理的肝S9的體外代謝體系中，不論加與不加NADPH，檳榔堿均被迅速代謝，各反應體系代謝檳榔堿的能力無明顯差別，半代謝期大約為60～70min。50μg/ml的檳榔堿具有明顯的細胞毒性，影響L-02肝細胞的生長增殖，以及對MTT的代謝能力，檳榔堿誘導的細胞損傷具有明顯的劑量依賴性。與單純檳榔堿處理組比較，肝S9預處理不論從細胞形態(tài)，還是從細胞MTT的代謝能力等方面均

4、提示肝S9在一定的程度上能保護細胞免除檳榔堿的毒性。經(jīng)肝S9處理后，L-02細胞可耐受300μg/ml檳榔堿的毒性作用。50℃熱處理1min后，肝S9仍具有相同的保護作用，與未處理的肝S9比較無明顯差別。 結(jié)論： 1.離子對RP-HPLC法檳榔堿測定的敏感性高、重現(xiàn)性好，是微量檳榔堿檢測的較理想的方法。通過改變洗脫液的組成，可用于肝勻漿、檳榔中檳榔堿的測定。 2.肝勻漿組分具有較強的代謝檳榔堿的能力，代謝率隨時間

5、變化呈指數(shù)增加，擬合的非線性回歸方程式為y=98.97e-0.0110X，微粒體酶、FMO對檳榔堿的代謝作用不明顯。 3.檳榔堿具有一定的細胞毒性，50μg/ml的檳榔堿對L-02肝細胞具有一定的毒性作用，檳榔堿誘導的L-02肝細胞毒性作用具有明顯的劑量依賴性。 4.肝S9能保護L-02肝細胞免除檳榔堿的毒性，0.05mg/ml的肝S9幾乎完全阻斷了300μg/ml檳榔堿的毒性作用，而微粒體酶、FMO在檳榔堿的代謝解毒過